重組蚊濃核病毒干擾載體的構(gòu)建及初步應(yīng)用的研究.pdf

1、研究背景:
　　 蚊媒傳染病流行范圍廣,傳播力強(qiáng),發(fā)病率高,全球每年有上億人感染瘧疾、登革熱等蚊媒病,死亡人數(shù)過百萬。我國已知蚊類18個(gè)屬、371個(gè)種和亞種,涵蓋瘧疾、登革熱、乙型腦炎、絲蟲病的主要媒介。中國疾病預(yù)防控制中心報(bào)告顯示我國僅2006年瘧疾發(fā)病就超過6萬例,疫情出現(xiàn)回升,流行性乙型腦炎在近年也出現(xiàn)局部爆發(fā)。總之,蚊媒傳染病的流行嚴(yán)重危害人類生命健康,影響社會的穩(wěn)定,阻礙經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。媒介蚊蟲防治是控制蚊媒傳染病流行的重

2、要措施。目前,對于登革熱、黃熱病、西尼羅病毒病等蚊媒病毒傳染病尚無特效治療方法或特異性預(yù)防手段,而瘧原蟲對傳統(tǒng)藥物抗藥性也逐漸凸顯,媒介控制在預(yù)防其發(fā)生和流行方面的重要性就顯得更加突出,而尋求有效的控制方法則成為世界醫(yī)學(xué)界面臨的重要課題。媒介化學(xué)防治由于其突出的效果在蚊媒防治中一度占有統(tǒng)治地位,但是隨著傳統(tǒng)上的化學(xué)防治所造成的嚴(yán)重環(huán)境污染,及蚊蟲耐藥性的產(chǎn)生等弊端的日益顯現(xiàn),蚊蟲的生物防治愈來愈受到人們的青睞。生物防治主要應(yīng)用蚊蟲病原體

3、、寄生物、捕食物來達(dá)到防治效果,或通過轉(zhuǎn)基因蚊作為控制的措施,這就要求對蚊蟲病原體基因組有更好的了解及尋找新的防治策略。
　　 近年隨著RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)的不斷發(fā)展,不僅成為昆蟲基因組功能研究的有力工具,而且開始在害蟲防治上嶄露頭角,如通過飼喂表達(dá)dsRNA的作物或食物來沉默特定基因進(jìn)而控制害蟲,這為害蟲防治領(lǐng)域開辟了一個(gè)新的途徑。由此可以想象在蚊蟲的生物防治策略上RNAi將會有很大的發(fā)

4、展空間。但是RNAi在蚊蟲防治應(yīng)用上卻存在一個(gè)重要的瓶頸--就是如何更有效的將RNAi序列注入到細(xì)胞中或蚊蟲體內(nèi)。因此,要想應(yīng)用在昆蟲基因組研究及蚊媒防治上,就需要一種更有效的傳遞機(jī)制。
　　 濃核病毒(Densovirus,DNV)屬自主性的細(xì)小病毒,主要感染昆蟲綱與甲殼綱的非脊索動物。目前,濃核病毒亞科主要劃分為四屬即:濃核病毒屬(Deflsovirus)、短濃核病毒屬(Brevidensovirus)、黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?

5、Pefudensovirus)、相對病毒屬(Iteravirus)、同時(shí)還包括一些暫時(shí)未歸類的濃核病毒。蚊濃核病毒(Mosquito densoviruses,MDV)屬短濃核病毒屬,主要包括埃及伊蚊濃核病毒(Aeries aegypti densovirus,AaeDNV))等目前共分離得到16株?？商禺愋缘母腥疚妙?。MDV在外界相對穩(wěn)定,宿主特異性強(qiáng)僅僅感染蚊類,可通過水平傳播與垂直傳播方式在蚊種群內(nèi)擴(kuò)散。MDV基因組相對簡單,屬小

6、分子DNA病毒,基因組長大約4000nt左右,由左側(cè)的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2編碼區(qū)與右側(cè)的結(jié)構(gòu)蛋白VP編碼區(qū)(分別由p7、p60啟動子啟動),以及兩端的重復(fù)序列(Inverted repeat sequences,IRS)組成。其全基因組在亞克隆入質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染蚊細(xì)胞后,可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)早期蛋白NS1,通過早期蛋白識別兩側(cè)IRS并通過自身酶的作用將全基因組從載體上脫離,并回復(fù)野生性狀。這些特點(diǎn)使MDV在基因工程中具有安全,便于操作等優(yōu)勢,

7、使其具有發(fā)展為RNAi病毒載體巨大的潛在價(jià)值。
　　 本研究通過基因工程方法用可以示蹤的GFP蛋白基因代替AaeDNV VP蛋白基因,并在NS與GFP之間插入人工內(nèi)含子,在內(nèi)含子構(gòu)建以蚊蟲PutativeU6snRNA polymerase Ⅲ(PolⅢ)promoter為啟動子表達(dá)的siRNA表達(dá)框,來構(gòu)建重組蚊濃核病毒干擾載體。靶基因選擇的是蚊蟲空泡ATP酶(Vacuolar ATPase,V-ATPase),V-ATP-a

8、se不僅維持蚊蟲正常生理功能還與瘧原蟲等病原體入侵蚊體內(nèi)息息相關(guān)。最終將檢測重組病毒載體及重組病毒顆粒在蚊C6/36細(xì)胞系與白紋伊蚊幼蟲體內(nèi)的干擾效果并對白蚊伊蚊實(shí)驗(yàn)室株的致死效果進(jìn)行初步測試。
　　 人工內(nèi)含子可以自主剪切,靶基因干擾序列表達(dá)框隨內(nèi)含子剪切而不會影響外顯子的作用,不會造成蛋白改變。另外內(nèi)含子片段很小,而插入的RNAi編碼框整體也很小,如果這種含有內(nèi)含子的編碼框插入到野生病毒的VP或NS蛋白編碼框內(nèi),重組病毒的基

9、因組長度不會影響其包裝效率,而最終使得重組的可自我復(fù)制型病毒成為可能,也為我們下一步將基于RNAi的重組病毒發(fā)展為生物殺蟲劑打下了基礎(chǔ)。
　　 目的:構(gòu)建基于人工內(nèi)含子內(nèi)插入干擾序列表達(dá)框的重組AeaDNV干擾載體。驗(yàn)證人工內(nèi)含子在昆蟲細(xì)胞內(nèi)是否可以正常剪切,內(nèi)含子內(nèi)的RNAi干擾載體是否能在白紋伊蚊C6/36細(xì)胞內(nèi)與白紋伊蚊幼蟲體內(nèi)干擾相應(yīng)靶基因V-ATPase,檢測抑制效果。初步測試重組病毒的殺蚊效果。并為最終發(fā)展可自我復(fù)制

10、重組蚊濃核病毒奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:根據(jù)白紋伊蚊V-ATPase的序列人工合成3對SiRNA序列使用lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞,以β-actin為內(nèi)參,real-timePCR法篩選對V-ATPase有較高抑制效果的siRNA序列。綠色熒光蛋白GFP作為報(bào)告基因連接到AaeDNV的非結(jié)構(gòu)蛋白NSl基因編碼區(qū)C端,構(gòu)建成質(zhì)粒載體pNSl-GFP,以NSl-GFP融合蛋白的形式,以病毒p7啟動子啟動表達(dá)。

11、應(yīng)用基因重疊延伸拼接PCR法(Gene splicing by overlapping extension PCR,SOE PCR)獲得人工內(nèi)含子全序列。人工內(nèi)含子5-端剪接點(diǎn)(供位)序列來自人類β-球蛋白基因第一內(nèi)含子,3’-端剪接點(diǎn)(受位)序列來自免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因內(nèi)含子,并在中間引入MluI與NheI限制性酶切位點(diǎn)以便插入靶基因干擾序列表達(dá)框。在兩端加入AgeI限制性酶切位點(diǎn),將人工內(nèi)含子加入到NSl-GFP融合蛋白編碼框位

12、于NSl編碼區(qū)與GFP編碼區(qū)之間。人工合成岡比亞按蚊與埃及伊蚊Putative U6snRNApolymerase Ⅲ(PolⅢ)啟動子,分別以兩種啟動子,三種siRNA序列構(gòu)建6種shRNA表達(dá)框:P 1/P2+SiRNA(SenSe)+LOOP(tcaagag)+SiRNA(antisense)+Terminator(tttttttt),插入到人工內(nèi)含子內(nèi)相應(yīng)酶切位點(diǎn),構(gòu)建成6種重組病毒RNAi載體質(zhì)粒。將6種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞

13、,分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48、60、96 h,real-timePCR檢測目的基因的表達(dá)量。分別以上各重組病毒載體以pUCA載體為輔助載體共轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞,獲得重組病毒后感染白紋伊蚊一期幼蟲進(jìn)行體內(nèi)抑制實(shí)驗(yàn),感染后5天分別篩選不同感染度的白紋伊蚊幼蟲,提取RNA,real-time PCR檢測目的基因抑制效果。通過不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)病毒感染組幼蚊的死亡數(shù)目來測定重組AaeDNV的致死效應(yīng)。
　　 結(jié)果:成功的構(gòu)建了靶基因V-A

14、TPase的重組AeaDNV RNAi載體。(1)shRNA表達(dá)元件插入到內(nèi)含子內(nèi),以內(nèi)含子內(nèi)表達(dá)框的形式進(jìn)行表達(dá),插入部位外顯子NS-GFP基因表達(dá)融合蛋白未受影響,證明人工內(nèi)含子可以在昆蟲細(xì)胞內(nèi)正常剪切。(2)重組載體的報(bào)告分子GFP有助于我們對shRNA轉(zhuǎn)染和表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測。(3)有效干擾序列的重組載體質(zhì)?；?qū)?yīng)重組病毒在C6/36細(xì)胞和白紋伊蚊一期幼蟲內(nèi)對目的基因都有明顯的抑制效果,實(shí)驗(yàn)組的目的基因表達(dá)率明顯降低與對照組相比差

15、異顯著(P<0.05)。(4)埃及伊蚊Putative U6snRNApolymerase Ⅲ(PolⅢ)啟動子所啟動表達(dá)的shRNA無論在白紋伊蚊細(xì)胞系中還是在活體中比岡比亞按蚊Putative U6snRNA polymeraseⅢ(PolⅢ)啟動子都起到了更好的靶基因抑制效果。(5)實(shí)驗(yàn)室條件下重組病毒對白紋伊蚊有較好的致死率。
　　 結(jié)論:首次以病毒直接感染的方式對蚊蟲進(jìn)行了RNAi研究。以人工內(nèi)含子中插入目的基因干擾序