重組人組織因子腺病毒干擾載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人血管平滑肌的體外研究.pdf

1、背景/意義：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展是一種多因素綜合作用導(dǎo)致的慢性血管性疾病，單獨(dú)的一種學(xué)說不能完全解釋AS的病因及發(fā)病過程。炎癥反應(yīng)和凝血系統(tǒng)的激活在動脈粥樣硬化發(fā)病過程中起著重要作用，炎癥可導(dǎo)致凝血系統(tǒng)的激活，而凝血活動又可影響炎癥的反應(yīng)。組織因子(tissue factor，TF)作為一種天然的凝血系統(tǒng)啟動子，在動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)和凝血級聯(lián)反應(yīng)中均扮演著重要角色。將TF作為

2、靶點(diǎn)，有可能成為治療AS引起的各種急性心血管性疾病的一個(gè)可靠靶點(diǎn)。本研究試圖利用RNA干擾原理，以腺病毒為載體，將針對TF基因的外源性發(fā)夾環(huán)小干擾RNA片斷導(dǎo)入腺病毒載體，通過體外重組技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TF-shRNA的重組體腺病毒，并觀察這種重組腺病毒感染白介素-18(interleukin-18，IL-18)刺激下，血管平滑肌細(xì)胞中TF產(chǎn)生的變化，以探討RNA技術(shù)在治療血栓性疾病的的應(yīng)用前景，并為研究TF的多種生物學(xué)效應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，

3、為將TF作為基因治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為治療動脈粥樣硬化引發(fā)的各種疾病開辟新途徑。本實(shí)驗(yàn)主要分成以下3部分。
　　 方法和內(nèi)容：
　　 第一部分人組織因子干擾載體的構(gòu)建和真核表達(dá)
　　 目的：1、篩選較高轉(zhuǎn)染效率的轉(zhuǎn)染試劑，并進(jìn)一步優(yōu)化該轉(zhuǎn)染試劑在轉(zhuǎn)染人TF小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)時(shí)的轉(zhuǎn)染條件。2、構(gòu)建攜帶TF基因的發(fā)夾環(huán)小干擾RNA(short hairpin R

4、NA，shRNA)的質(zhì)粒表達(dá)載體，觀察重組質(zhì)粒對TF基因的沉默效果。
　　 方法：1、分別利用含GFP綠色熒光蛋白的報(bào)告質(zhì)粒pEGFP-N1和Lipofectamine TM2000與Lipofectamine TM-PLUS進(jìn)行轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率；參照文獻(xiàn)和RNA干擾靶序列設(shè)計(jì)原則，化學(xué)合成含有熒光的siRNA，并利用篩選具有較高轉(zhuǎn)染效率的轉(zhuǎn)染試劑，優(yōu)化其轉(zhuǎn)染人TF的siRNA時(shí)的轉(zhuǎn)染條件。2、設(shè)計(jì)合成針

5、對TF基因的小發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA(shRNA)，克隆至含CMV啟動子的穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體pShuttle-CMV-1.0，構(gòu)建重組質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體-Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞株，反轉(zhuǎn)錄半定量聚合酶鏈反應(yīng)法(reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR)檢測攜帶TF-shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體抑制TF mRNA表達(dá)的效果。3、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差

6、(Means±S.D.)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較采用Bonferroni法。
　　 結(jié)果：1、Lipofectamin TM2000具有較高的轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)過優(yōu)化其轉(zhuǎn)染siRNA的效率大于90％。2、成功構(gòu)建了攜帶TF-shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體pShuttle-CMV-TF-shRNA，酶切鑒定及測序證實(shí)插入的外源基因序列正確。3、RT-PCR方法檢測重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，HEK-293細(xì)胞中TF mRNA

7、的表達(dá)變化。轉(zhuǎn)染對照組TF mRNA值為3.66±0.01，在轉(zhuǎn)染含有TF shRNA重組質(zhì)粒組后24h、48h和72h，TF mRNA表達(dá)水平為2.11±0.01、1.21±0.05和0.56±0.01，與對照組相比，TF mRNA水平顯著降低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59076.697，P=0.000)，提示了TF shRNA重組質(zhì)粒組能明顯降低TF基因表達(dá)水平。
　　 結(jié)論：1、經(jīng)過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，陽離子脂質(zhì)體Lipofect

8、amineTM2000可以將化學(xué)合成的siRNA高效地轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。2、成功構(gòu)建攜帶TF-shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體，構(gòu)建的重組質(zhì)?？擅黠@下調(diào)TF基因mRNA的表達(dá)水平，RNA干擾效果明顯。
　　 第二部分?jǐn)y帶人組織因子的重組腺病毒載體的制備和構(gòu)建
　　 目的：構(gòu)建攜帶TF-shRNA的重組腺病毒表達(dá)載體。
　　 方法：連接線性化腺病毒骨架質(zhì)粒(LacZ)和帶有CMV啟動子的穿梭載體質(zhì)粒pShuttle-TF-s

9、hRNA，采用磷酸鈣共沉淀法將兩種質(zhì)粒表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化HEK-293包裝細(xì)胞，兩種質(zhì)粒在HEK-293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組以獲得重組體腺病毒，氯化銫密度梯度離心法純化并檢測病毒滴度，用構(gòu)建的重組腺病毒感染Hela細(xì)胞，檢測重組腺病毒的生物安全性。3、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±S.D.)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較采用Bonferroni法。
　　 結(jié)果：采用同源重組法構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，

10、酶切鑒定后進(jìn)行大量擴(kuò)增，氯化銫密度梯度離心法純化，檢測病毒滴度為3×1010pfu/ml。MOI值100的病毒液感染HeLa細(xì)胞后，各組細(xì)胞生長狀態(tài)無顯著性差異(P=0.329)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了攜帶TF-shRNA的腺病毒表達(dá)載體Ad-TF-shRNA，載體穩(wěn)定，易于純化和擴(kuò)增，病毒滴度高，并具有較高的生物安全性。
　　 第三部分人重組組織因子腺病毒的體外功能初步研究
　　 目的：在成功構(gòu)建腺病毒表達(dá)載

11、體Ad-TF-shRNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，探討在白介素-18(interleukin-IL-18，IL-18)作用下，腺病毒載體對人臍動脈血管平滑肌TF抗原、凝血活性、mRNA和蛋白表達(dá)的變化。
　　 方法：1、采用組織塊培養(yǎng)法分離人臍動脈血管平滑肌細(xì)胞，α-actin免疫組織化學(xué)檢查陽性鑒定為平滑肌細(xì)胞。采用第3-4代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。2、采用直接感染法，用重組腺病毒感染血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)，確定最佳MOI，

12、采用MTT法檢測重組腺病毒對血管平滑肌細(xì)胞生長狀態(tài)的影響；一期凝血法、ELISA法檢測在IL-18作用下，分別于感染后8、24、48和72h檢測細(xì)胞TF抗原、凝血活性的變化，并應(yīng)用RT-PCR及Western b1ot方法檢測感染后血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)TF基因mRNA及蛋白表達(dá)水平的改變。3、所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±S.D.)表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較采用Bonferroni法。
　　 結(jié)果：

13、1、相差顯微鏡檢查傳代后的血管平滑肌細(xì)胞呈“峰”、“谷”狀生長；α-actin免疫組織化學(xué)檢查符合平滑肌細(xì)胞特征，第3-4代用于本實(shí)驗(yàn)研究。2、當(dāng)MOI為50時(shí)，平滑肌細(xì)胞的感染效率為80％以上，當(dāng)MOI為100時(shí)，平滑肌細(xì)胞的感染效率幾乎為90％，說明重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染效率高，且細(xì)胞生長狀態(tài)良好。3、臺盼蘭法分別在感染后1、3、4和8d細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，與對照組相比，在Ad-TF-shRNA和Ad-GAPDH-shRNA感染細(xì)胞天數(shù)

14、相同時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)無顯著性差異；各組感染后細(xì)胞生長狀態(tài)良好，隨著感染天數(shù)的增多，細(xì)胞數(shù)增多，有顯著性差異(P＜0.05)，采用時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)與對照組相比，無顯著性變化(P＞0.05)。4、在100ng/mL的IL-18作用下，與對照組相比，平滑肌細(xì)胞8h、24h、48h和72h后上清液中TF抗原含量和凝血活性都有顯著性升高(P=0.000)，含有TF特異片段的重組腺病毒Ad-TF-shRNA感染SMCs8h后，與IL-18作用處理組相比，T

15、F抗原含量和凝血活性均明顯降低(P=0.000)。RT-PCR結(jié)果顯示，在感染后24、48和72內(nèi)，與對照組相比相比，Ad-TF-shNA能顯著降低細(xì)胞內(nèi)TF表達(dá)水平(P=0.000)；Western-blot結(jié)果亦證實(shí)，我們構(gòu)建的靶向TF的Ad-TF-shRNA感染平滑肌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)TF蛋白明顯下降，與RT-PCR結(jié)果一致。以上結(jié)果提示IL-18可誘導(dǎo)血管平滑肌產(chǎn)生大量的TF，并具有較高的凝血活性，構(gòu)建的攜帶TF shRNA的重組腺

16、病毒Ad-TF可降低血管平滑肌細(xì)胞中TF含量和凝血活性，并且這種抑制作用是在mRNA和蛋白水平的抑制。
　　 結(jié)論：1、重組腺病毒Ad-TF對體外培養(yǎng)的人臍動脈血管平滑肌生長狀態(tài)無影響。2、IL-18可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生并表達(dá)TF，這種誘導(dǎo)作用可以由腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾TF基因表達(dá)后，明顯抑制TF含量和凝血活性，且這種作用是在mRNA及蛋白水平的抑制。
　　 創(chuàng)新點(diǎn)：
　　 1、本研究首次運(yùn)用發(fā)夾環(huán)小干