腺病毒介導(dǎo)的重組人HIF-1α基因誘導(dǎo)大鼠后肢缺血骨骼肌組織血管再生的作用.pdf

1、第一部分重組人HIF-1α的真核表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 目的：構(gòu)建重組人HIF-1α真核表達(dá)載體質(zhì)粒，為進(jìn)行治療性血管再生研究做準(zhǔn)備。 方法：從HeLa細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別調(diào)取目的基因片段A和B，與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，LB平板培養(yǎng)基篩選菌落，抽提質(zhì)粒。測(cè)序正確后雙酶切先后克隆進(jìn)入pcDNA4/HisMaxA載體。 結(jié)果：獲得重組的人HIF-1α真

2、核表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的目的基因分子量與預(yù)計(jì)的相同，插入pcDNA4/HisMaxA載體部位正確。 結(jié)論：重組的人HIF-1α，所選用的pcDNA4/HisMax可高表達(dá)目的基因，為利用其進(jìn)行治療性血管再生研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分重組人HIF-1α的真核表達(dá)載體質(zhì)粒的功能表達(dá) 目的：構(gòu)建編碼重組人HIF-1α真核表達(dá)載體質(zhì)粒，研究體外培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞中靶基因表達(dá)的有效性。 方法：從HeLa細(xì)胞中

3、提取總RNA，RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別調(diào)取目的基因片段A和B，與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，LB平板培養(yǎng)基篩選菌落，抽提質(zhì)粒。測(cè)序正確后雙酶切先后克隆進(jìn)入pcDNA4/HisMaxA載體。用構(gòu)建完成的重組HIF-1α質(zhì)粒和空白病毒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，并在不同時(shí)相收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR和Westernblot檢測(cè)。 結(jié)果：檢測(cè)靶基因VEGFmRNA表達(dá)及其蛋白翻譯的結(jié)果類似。轉(zhuǎn)

4、染細(xì)胞24-72小時(shí)之后，重組HIF-1α質(zhì)粒各組VEGFmRNA的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照各組，差異顯著(P＜0.001)。與空白對(duì)照組相比，重組rHIF-1α質(zhì)粒組VEGF蛋白的表達(dá)在24小時(shí)組即有明顯增加，但與48小時(shí)組相比差異無(wú)顯著性(P＞0.05)與72小時(shí)組相比差異顯著(P＜0.001)。72小時(shí)組的表達(dá)量最高，與其它各組比較差異均顯著(P＜0.001)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組的人HIF-1α質(zhì)粒載體之后，在體外轉(zhuǎn)染哺

5、乳細(xì)胞中可有效地表達(dá)靶基因VEGFmRNA并翻譯成相應(yīng)的蛋白，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的目的。為利用其進(jìn)行治療性血管再生研究奠定了基礎(chǔ)。 第三部分應(yīng)用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人HIF-1α重組腺病毒 目的：利用AdMax腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人重組HIF-1α基因腺病毒并在293細(xì)胞中擴(kuò)增制備重組病毒。 方法：自先期構(gòu)建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表達(dá)載體中用RT-PCR法擴(kuò)增出rhHIF-1α基因片段，將其克隆入線性

6、化的pEGFP1-C1質(zhì)粒中，用PCR法擴(kuò)增EGFP-rhHIF-1α基因片段，將其克隆入PUC18質(zhì)粒中。酶切構(gòu)建好的pUC18-rhHIF-1α載體并克隆進(jìn)入穿梭質(zhì)粒PDC316中，將構(gòu)建好的穿梭質(zhì)粒PDC316-rhHIF-1α載體和骨架病毒pBHGlox△1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝成重組的病毒顆粒，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)。 結(jié)果：經(jīng)限制性內(nèi)切酶檢測(cè)和GFP表達(dá)證實(shí)成功地構(gòu)建了攜帶重組人HIF-α基因的重組腺病

7、毒載體并制備出高滴度重組病毒。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了攜帶rhHIF-1α基因片段的重組腺病毒載體，為進(jìn)一步血管再生研究奠定了基礎(chǔ)。 第四部分 腺病毒介導(dǎo)的重組人HIF-1α誘導(dǎo)大鼠后肢缺血模型的血管再生作用 目的：觀察成年大鼠和老年大鼠體內(nèi)注射先期構(gòu)建的腺病毒介導(dǎo)的重組人HIF-1α表達(dá)載體在缺血的骨骼肌組織對(duì)血管的再生作用并進(jìn)行比較。 方法：建立大鼠后肢缺血模型，成年(n=8)及老年(n=7)組均

8、隨機(jī)分成缺血對(duì)照組(A、C組)和缺血治療組(B、D組)。建模24小時(shí)后，B、D兩組右后肢缺血骨骼肌局部5處分別注射腺病毒rh-HIF-1α載體(每處1×108pfu/0.1m1)，A、C兩組在左后肢相應(yīng)部位注入PBS液(每處0.1m1)。術(shù)后2周、4周麻醉大鼠后，切取四組大鼠后肢缺血骨骼肌組織進(jìn)行HE染色和血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組化檢查。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大體觀察B、D組在同等干預(yù)下，術(shù)后四周后肢缺血狀況有明顯改善，與自身對(duì)照組及術(shù)后