重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7基因腺病毒載體轉(zhuǎn)染對(duì)兔受損椎間盤影響的體內(nèi)研究.pdf

1、椎間盤退變性疾病包括許多種疾病，給人類健康帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，然而，目前所有的治療方式都針對(duì)的是椎間盤退變?cè)斐傻陌Y狀的緩解，而并非椎間盤退變本身。治療椎間盤退變的一個(gè)可能的方法就是將采用基因治療的方法將目的基因?qū)胱甸g盤內(nèi)。 目的： (1)建立可靠的、可重復(fù)的椎間盤退變的動(dòng)物模型； (2)構(gòu)建含有人類重組BMP-7基因的腺病毒載體；(3)將該腺病毒載體導(dǎo)入新西蘭大白兔椎間盤內(nèi)，觀察BMP-7對(duì)新西蘭大白兔受損椎間盤的影

2、響。 方法： (1)：健康新西蘭大白兔6只，將L3/4作為對(duì)照椎間盤，不進(jìn)行針刺也不進(jìn)行暴露；L4/5作為假手術(shù)椎間盤，只進(jìn)行暴露而不進(jìn)行針刺；L5/6椎間盤作為手術(shù)椎間盤，手術(shù)暴露后用24G針頭從椎間盤的前外側(cè)針刺三次。觀察4周后其椎間盤高度、MRI信號(hào)改變、髓核含水量、髓核s-GAG含量等變化，對(duì)椎間盤進(jìn)行組織學(xué)觀察，了解受損椎間盤的改變。 (2)采用共轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建成功pAd-BMP7重組腺病毒，293細(xì)胞

3、包裝、擴(kuò)增和純化后對(duì)重組腺病毒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)及酶切鑒定，將鑒定好的病毒克隆進(jìn)一步擴(kuò)增、純化和測(cè)定滴度。驗(yàn)證其使用的安全性 (3)取新西蘭大白兔4只，將BMP-7基因的腺病毒載體注射入新西蘭大白兔椎間盤內(nèi)，3天后通過(guò)RT-PCR、westernblot觀察BMP-7的表達(dá)情況。取新西蘭大白兔20只，將L3/4椎間盤刺傷后注入20μl生理鹽水；L4/5椎間盤刺傷后注入20μl的Ad-BMP7；3、L5/6留做對(duì)照。在術(shù)后2周、

4、4周、8周、12周，測(cè)量椎間盤高度、MRI信號(hào)強(qiáng)度、髓核含水量、髓核s-GAG含量，觀察BMP-7對(duì)新西蘭大白兔受損椎間盤在這些方面的影響。 結(jié)果：(1)針刺損傷椎間盤4周后，與L3/4、L4/5椎間盤相比，L5/6椎間盤在椎間盤高度、MRI信號(hào)強(qiáng)度、髓核含水量、髓核s-GAG含量降低，HE染色證明L5/6椎間盤有退變性征象發(fā)生。 (2)成功構(gòu)建了腺病毒載體，經(jīng)測(cè)定其滴度為1.2×1012PFU/ml。 (3)注

5、射BMP-7的腺病毒載體，三天后就有BMP-7表達(dá)。在術(shù)后2周、4周、8周、12周，BMP-7基因腺病毒載體注射的L4/5椎間盤在椎間盤高度、MRI信號(hào)強(qiáng)度、髓核含水量、髓核s-GAG含量方面與L3/4椎間盤相比都能改善受損傷椎間盤的情況，接近L5/6正常椎間盤水平。 結(jié)論：針刺損傷椎間盤退變動(dòng)物模型是一種可靠的動(dòng)物模型，具有很好的重復(fù)性。用BMP-7基因的腺病毒載體對(duì)受損傷的新西蘭大白兔椎間盤進(jìn)行基因治療，可以很好的延緩受損椎