裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關病毒誘導成骨的實驗研究.pdf

1、隨著社會的發(fā)展，臨床上創(chuàng)傷和骨病的患者日益增多，而隨著醫(yī)學技術的日新月異，很多以前治療困難的骨科疾病在現在都有了新的治療方法。但這也對骨科臨床方面的一個老問題提出了新的要求，即“移植骨的來源”問題。臨床上各類的骨病，如骨折不愈合，骨不連，脊柱融合，骨腫瘤切除后缺損的填充，多次關節(jié)置換后面臨的骨缺損等疾病，都需要正常，健康，缺乏免疫源性的骨組織，但如果此時患者本身無法提供這樣的骨組織，那么這類骨病的治療將如何處理？現階段患者自身的髂骨移植

2、仍是治療這類疾病的金標準，患者自體的髂骨具有載體，含有骨誘導因子，骨生成細胞的三大基本成骨的要素。但同時也存在著取骨部位的并發(fā)癥，如出血，感染，延長手術時間等不利因素。而同種異體骨應用的明顯不利因素是價格昂貴，具有免疫源性以及傳播疾病的風險。
　　目前腺病毒相關病毒（Adeno-associated virus,AAV）顆粒是現在國際上公認的最具有臨床安全性的病毒載體。和傳統(tǒng)的腺病毒（Adenovirus,AV）不同，腺病毒相關病

3、毒可以高效定點整合至人染色體中，避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，對人類健康沒有危害性，目前在美國應用于臨床試驗研究。AAV具有病毒顆粒小，轉染率高，免疫源性低，在體內表達外源基因時間長，對分裂或不分裂的細胞都有很高的轉染效率等優(yōu)點，被視為最有前途的基因轉移載體之一，在世界范圍內的基因治療和疫苗研究中得到廣泛應用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）具有誘導體內干

4、細胞向成軟骨細胞和成骨細胞分化的能力。當 BMPs基因被裝載到病毒載體上，通過病毒轉染的過程可結合入細胞的基因組中，通過基因的轉錄，翻譯而合成相應 BMPs蛋白分泌到細胞外。分泌到細胞外的蛋白通過作用于自身或周圍的干細胞而誘導其向成軟骨細胞或成骨細胞分化。本實驗證明構建的AAV-BMP4具有良好的生物學活性。對異位骨組織形成過程的組織學分析證實該過程是通過軟骨化骨的方式誘導生成的。
　　骨組織工程中三個基本要素分別是細胞，生長因子

5、和載體。而現在常用的載體分別有羥基磷灰石（Hydroxyapatitie，HA）,脫鈣骨基質（Decalcified Bone Matrix，DBM）。羥基磷灰石是人體骨骼組織的主要無機組成成分，具有一定的硬度，表面多孔性，適于細胞的吸附，具有骨傳導性，但是不具備骨誘導性。脫鈣骨基質由同種異體骨或異種骨經脫鈣處理，能降低免疫原性的骨移植材料，主要成分為含有多種活性骨誘導因子的I型膠原成分，具有骨誘導性。包裝有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺相關病毒

6、（AAV-BMP4）吸附在Gelfoam膠原上后形成的復合物具有明顯的骨誘導性。當復合物被植入體內之后，Gelfoam上吸附的AAV-BMP4顆?？赊D染骨骼肌肉內的細胞，誘導新生骨組織的形成，具有明顯的骨誘導性。
　　本課題包括以下三部分：
　　1.裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關病毒的構建及其活性測定；
　　2.裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關病毒的體內成骨研究；
　　3.誘導生成的骨組織治療顱骨骨缺損的實驗研

7、究。
　　第一部分裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關病毒的構建及其活性測定
　　本實驗的目的是將BMP4基因構建入AAV載體內，通過三質粒共轉染293包裝細胞，然后進行細胞裂解，高速氯化銫梯度離心的方法純化出AAV-BMP4。并通過體外DNA dot-blot雜交的方式來確定其濃度。待AAV-BMP4的純化和濃度測定結束之后，將AAV-BMP4吸附于Gelfoam上并植入SCID小鼠的股肌袋內進行AAV-BMP4的活性測定。結

8、果顯示通過上述方法，可有效地構建出純化后濃度達5×1012 vp/ml的AAV-BMP4病毒顆粒。純化后的AAV-BMP4病毒顆粒植入小鼠的股肌袋內可成功誘導異位骨組織的形成，證明了本實驗構建的AAV-BMP4具有良好的生物學活性。對異位骨組織形成過程的組織學分析證實該過程是通過軟骨化骨的方式誘導生成的。
　　第二部分裝載骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的腺病毒相關病毒的體內成骨研究
　　本次進一步的研究是通過多種方法來探討在小鼠背部皮下應

9、用AAV-BMP4復合骨骼肌肉誘導異位成骨的可能性。實驗設計采用了兩種方法，一是應用整塊狀肌肉復合AAV-BMP4+Gelfoam，并將該復合物植入小鼠背部皮下來研究復合物的成骨能力的。二是將切碎后的骨骼肌肉預先移植入到小鼠的背部皮下，間隔特定時間后再在該部位植入 AAV-BMP4+Gelfoam復合物來研究這種方法在小鼠皮下的成骨能力。三組植入物在手術后的4，8,12周時接受X線檢查，結果示 HA/TCP組皮下和股肌袋中持續(xù)見明顯的高

10、信號影，DBM組未見明顯的高信號影，AAV-BMP4組三個時間段只在股肌袋可見高信號影。H.E和Von Kossa染色證實DBM組和AAV-BMP4組在小鼠的股肌袋中有新生骨形成，但小鼠的皮下部位未見明顯的新生骨形成。HA/TCP組未見明顯的新生骨組織形成；整塊骨骼肌肉包裹的AAV-BMP4+Gelfoam復合體在小鼠的背部皮下沒有誘發(fā)出明顯的骨組織形成。X線和microCT的檢查均證實了小鼠的背部皮下無明顯高信號影。組織學結果觀察顯示

11、植入小鼠背部皮下的骨骼肌肌纖維中未見到新生血管的長入，而骨骼肌肌細胞出現了壞死的表現；切碎后的骨骼肌肉預先植入小鼠的背部皮下4周后，在此基礎上重新植入的AAV-BMP4+Gelfoam復合體后4周出現了少量的新生骨組織。X線和microCT的檢查均證實了小鼠的背部皮下出現少量的高信號影，組織學觀察也可見少量的骨組織形成。
　　第三部分誘導生成的骨組織治療顱骨骨缺損的實驗研究
　　利用AAV-BMP4容易轉染體內骨骼肌細胞的特

12、性，然后誘導骨骼肌肌肉通過軟骨化骨的方法形成大量的骨組織。然后等待骨組織形成穩(wěn)定之后，取出這些骨組織移植入事先制備好的顱骨缺損的動物模型體內，用來修復小鼠的顱骨缺損。這種方法和干細胞為基礎的基因治療方法相比，省卻了干細胞的分離，體外培養(yǎng)，體外病毒的轉染，細胞復合載體等步驟，節(jié)約了時間，而且最重要的特點是需要成骨的部位不會出現骨組織的異常增多。該研究的方法包括體外應用Gelfoam吸附AAV-BMP4病毒形成復合物，并將該復合物移植入小鼠

13、的股部骨骼肌肌袋內。在誘導骨骼肌成骨后12周時，建立小鼠顱骨缺損模型，通過手術的方法取出AAV-BMP4誘導的異位形成的骨組織，并將其移植至新建小鼠的顱骨缺損處。本實驗的結果顯示，經修剪移植入小鼠顱骨缺損模型處的骨組織在植入缺損處后，沒有出現異常增生的現象，而是不斷地隨著時間的推移進行著外形的輕微改建，與宿主的骨組織結合良好。移植骨的外部毛刺逐漸消失，CT三維重建所示的移植骨表面的微小空洞逐漸融合消失,移植骨與宿主顱骨缺損的骨組織邊緣融

14、合良好，該顱骨缺損得到了良好的修復。
　　結論
　　1.體外構建的AAV-BMP4具有良好的生物學活性。植入骨骼肌內后可誘導形成新生的骨組織，組織學分析證實該過程是通過軟骨化骨的方式誘導生成的。
　　2.三組植入物中 AAV-BMP4+Gelfoam在骨骼肌肉誘導成骨能力最強，DBM其次，而HA則缺乏誘導成骨的能力。在小鼠的皮下部位，三種植入物都不具備誘導成骨的能力。整片肌肉包裹AAV-BMP4+Gelfoam的復合體