膠原礦化仿生骨聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白2相關(guān)多肽促進(jìn)骨再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：BMP-2 相關(guān)多肽促進(jìn)三維培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及礦化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：評(píng)價(jià)BMP-2 相關(guān)多肽誘導(dǎo)體外三維培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrowstromal cells，BMSCs）成骨分化及礦化的能力。
　　 方法：原代培養(yǎng)大鼠BMSCs，細(xì)胞傳至第3 代時(shí)，將細(xì)胞消化收集，與Cytodex TM3微載體三維培養(yǎng)體系復(fù)合培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后，將培

2、養(yǎng)基換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基加入終濃度為200 μg/ml的BMP-2 相關(guān)多肽，對(duì)照組不加多肽。復(fù)合培養(yǎng)7天和14天后，進(jìn)行死/活細(xì)胞染色，觀察微載體三維培養(yǎng)體系中BMSCs的存活情況，通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣含量和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色評(píng)價(jià)BMSCs 成骨分化情況，并進(jìn)行鈣黃綠素染色評(píng)價(jià)細(xì)胞礦化情況。
　　 結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)7天和14天后，BMSCs 在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組微載體三維培養(yǎng)體

3、系中均存活良好，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組鈣含量明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0 05)，實(shí)驗(yàn)組ALP 陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組，鈣黃綠素染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比細(xì)胞礦化明顯。
　　 結(jié)論：BMP--2 相關(guān)多肽能夠有效促進(jìn)體外三維培養(yǎng)的BMSCs 成骨分化及礦化。
　　 第二部分：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料的制備、特征及其對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

4、>　　 目的：制備納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料，觀察其特征并評(píng)價(jià)其對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞粘附、增殖及分化等生物學(xué)行為的影響。
　　 方法：用生物仿生自組裝的方法制備納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料(nano-Hydroxyapatite/collagen,nHAC)，在此基礎(chǔ)上聯(lián)合聚乳酸 (poly lacticacid,PLA)制備膠原礦化骨仿生骨基質(zhì)材料——納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nano-H

5、ydroxyapatite/collagen/poly lactic acid,nHAC/PLA），用X 射線衍射儀分析其晶體結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察其表面微觀形貌，將納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸與BMP-2活性多肽復(fù)合，構(gòu)建納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料。取第三代BMSCs 接種到材料上，以未結(jié)合多肽的納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸作為對(duì)照，采用MTT法檢測(cè)BMSCs 在材料表面的增殖；沉淀法檢測(cè)BMSCs 在材料

6、表面的粘附率；掃描電鏡觀察比較BMSCs 在材料表面的生長(zhǎng)形態(tài)；通過檢測(cè)細(xì)胞中的堿性磷酸酶活性及鈣離子濃度，觀察BMSCs 在材料表面的分化情況。
　　 結(jié)果：X 射線衍射分析結(jié)果顯示，納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復(fù)合材料的主要成分是羥基磷灰石(HA)；掃描電鏡結(jié)果顯示：該復(fù)合材料是一種疏松多孔結(jié)構(gòu)，孔徑從幾十微米至300μm不等，并且孔與孔之間有連通。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料

7、與單純納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸相比，能夠促進(jìn)BMSCs的粘附和向成骨細(xì)胞方向，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對(duì)BMSCs的增殖能力沒有影響(P>0.05)。
　　 結(jié)論：BMP--2活性多肽可以顯著改善納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復(fù)合材料的細(xì)胞相容性和生物活性，負(fù)載BMP-2活性多肽的納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復(fù)合材料是一種理想的骨組織工程支架材料。
　　 第三部分：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2

8、 相關(guān)多肽仿生骨基質(zhì)材料異位成骨的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：評(píng)價(jià)納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽仿生骨基質(zhì)材料的異位成骨能力。
　　 方法：制備納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料，采用高效液相色譜儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)BMP-2 相關(guān)多肽的釋放量，觀察BMP-2 相關(guān)多肽的體外釋放規(guī)律。將48只成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為四組，在A組、B組、C組大鼠背部肌肉內(nèi)分別植入3mg、2mg、1mg的B

9、MP-2 相關(guān)多肽與納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸復(fù)合材料；在D組大鼠背部肌肉內(nèi)植入單純納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸，于4 周和8 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)將大鼠分批處死，經(jīng)CT 三維重建、組織學(xué)觀察及鈣含量測(cè)定檢測(cè)植入材料的異位成骨情況。
　　 結(jié)果：體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BMP-2 相關(guān)多肽釋放規(guī)律為：第1天表現(xiàn)為爆發(fā)性釋放，釋放量為29.57%,以后緩慢持續(xù)釋放,至21d 累積釋放量達(dá)65.98%。A、B、C組，在各時(shí)間點(diǎn)的CT 三維重建

10、、組織學(xué)觀察及鈣含量檢測(cè)結(jié)果均表明其異位成骨能力優(yōu)于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中A、B 兩組的異位成骨能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）,但兩組均優(yōu)于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　 結(jié)論：BMP--2 相關(guān)多肽以納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸支架材料為載體能夠緩慢釋放。BMP-2 相關(guān)多肽可以顯著增強(qiáng)納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸的骨誘導(dǎo)活性，這種骨誘導(dǎo)性存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。納米羥基磷灰石/膠原

11、/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料能夠誘導(dǎo)異位骨形成，是一種具有良好骨誘導(dǎo)性的仿生骨修復(fù)材料。
　　 第四部分：納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽仿生骨基質(zhì)材料促進(jìn)大鼠顱骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽仿生骨基質(zhì)材料促進(jìn)大鼠顱骨缺損修復(fù)的可行性和有效性。
　　 方法：成年SD大鼠24只，在大鼠頂骨左、右兩側(cè)分別制備直徑5mm的顱骨缺損，左

12、側(cè)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,植入納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸/BMP-2 相關(guān)多肽復(fù)合材料，對(duì)側(cè)設(shè)為對(duì)照組，植入納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸，于4和12 周時(shí)間點(diǎn)將大鼠分批處死，進(jìn)行大體觀察、CT 三維重建、組織學(xué)觀察、掃描電鏡觀察和透射電鏡觀察，取術(shù)后12周的標(biāo)本進(jìn)行Masson 三染、免疫組化染色和生物力學(xué)檢測(cè)，比較各組材料促進(jìn)骨再生修復(fù)骨缺損的能力。
　　 結(jié)果：CT 三維重建結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組4 周時(shí)可見片狀高密度影，12 周時(shí)可見骨缺

13、損完全愈合。對(duì)照組4 周時(shí)僅骨缺損邊緣可見輕微的片狀致密影，12 周時(shí)高密度影有所增強(qiáng)，面積增大，接近缺損面積的1/2，未能完全修復(fù)骨缺損。組織學(xué)觀察結(jié)果顯示術(shù)后4 周，實(shí)驗(yàn)組骨缺損處可見大量新骨生成，而對(duì)照組僅有少量新骨生成；術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)組可見大部分支架材料降解，新生骨與宿主骨之間達(dá)到完全骨性結(jié)合，對(duì)照組支架材料部分降解，殘余支架被新生骨組織包圍。在各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組新骨形成面積百分比均大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

14、掃描電鏡結(jié)果顯示：4 周時(shí)兩組材料部分降解，可見成骨細(xì)胞黏附和類骨質(zhì)形成，實(shí)驗(yàn)組材料與正常骨組織有部分鍵合，對(duì)照組材料與正常骨組織間存在明顯間隙；12 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組材料大部分降解并由板層骨取代，骨缺損完全修復(fù)，對(duì)照組骨缺損部分修復(fù)。透射電鏡結(jié)果顯示：4 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組材料內(nèi)部可見功能活躍，代謝旺盛的成骨細(xì)胞，分泌的膠原排列無序，12 周時(shí)可見大量成骨細(xì)胞，在骨小梁表面成層排列，部分成骨細(xì)胞演變?yōu)楣羌?xì)胞，膠原排列有序緊密。
　　 對(duì)照組

15、在材料周圍僅見少量成骨細(xì)胞，其分泌膠原功能不活躍。術(shù)后12 周時(shí)，Masson三染結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組骨缺損處存在大量紅色的成熟鈣化組織，對(duì)照組僅見少量綠色的新生骨樣組織。骨鈣素和骨橋蛋白免疫組化染色結(jié)果進(jìn)一步印證了HE 染色和Masson 三染的發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組可見大量骨鈣素陽(yáng)性和骨橋蛋白陽(yáng)性的新生骨組織，明顯多于對(duì)照組骨鈣素陽(yáng)性和骨橋蛋白陽(yáng)性的骨組織。生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組最大壓力載荷和載荷/應(yīng)變比值均明顯高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P