聚乙烯亞胺介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺損臨床常見。作為治療骨缺損金標(biāo)準(zhǔn)的自體骨移植，由于存在取骨量有限和取骨區(qū)并發(fā)癥，已不能滿足骨缺損治療的需要。組織工程學(xué)的興起為治療骨缺損帶來了新的希望。骨組織工程利用具有成骨能力或潛能的種子細(xì)胞與生物材料在體外復(fù)合后植入體內(nèi)，通過新生的骨組織修復(fù)骨缺損，是理想的治療模式。
　　 組織工程有三大要素，即種子細(xì)胞、誘導(dǎo)因子和支架。其中種子細(xì)胞是其中最基本也是首要的環(huán)節(jié)。干細(xì)胞有自我復(fù)制及多

2、向分化潛能，是組織工程最理想的種子細(xì)胞。目前干細(xì)胞的來源主要有骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞[1]、胚胎干細(xì)胞[2]、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞[3]等。骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞含量較低，所需肌肉取材較難;胚胎來源的干細(xì)胞存在免疫排斥及倫理問題;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為組織工程骨的種子細(xì)胞已被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可，以往骨組織工程種子細(xì)胞的研究多集中于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但其存在數(shù)量少、取材困難、體外培養(yǎng)相對(duì)困難且易老化、病人不易接受等缺點(diǎn)。
　　 自從2001年Zuk[4

3、]等從人體抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中第一次分離獲得具有多向分化潛能的干細(xì)胞，即脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)以來，脂肪干細(xì)胞的研究成為繼骨髓干細(xì)胞之后又一熱點(diǎn)。研究表明[5]ADSCs體外特定誘導(dǎo)條件下實(shí)現(xiàn)了向骨、軟骨、脂肪、肌肉、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及肝細(xì)胞方向分化。ADSCs以其自體來源、容易獲取、細(xì)胞充足、多向分化、基因穩(wěn)定表達(dá)、自體移植無免疫排斥反應(yīng)、不涉及醫(yī)學(xué)倫理學(xué)問

4、題等特點(diǎn)可能成是構(gòu)建組織工程化骨組織較理想的種子細(xì)胞[6]。
　　 誘導(dǎo)因子在是組織工程的三要素之一，目前骨組織工程誘導(dǎo)因子來源主要是三種途徑:直接加入誘導(dǎo)因子、通過載體緩釋誘導(dǎo)因子和基因治療技術(shù)使靶細(xì)胞自身表達(dá)釋放誘導(dǎo)因子等方面。前兩者是單純給予的外源性誘導(dǎo)因子，但組織工程研究中，細(xì)胞因子無論是從天然生物中提純，還是用基因工程表達(dá)，均存在程序復(fù)雜，產(chǎn)量低，活性不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，因此如何有效發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)因子適時(shí)、適量效用，利用細(xì)胞與

5、基質(zhì)材料特異性勃附，細(xì)胞增殖，定向分化，發(fā)揮正常的生理功能，以實(shí)現(xiàn)最終理想的功能替代，一直是組織工程研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)，基因工程技術(shù)與組織工程的結(jié)合為以上問題的解決提供了可供選擇的良好辦法?；蚣夹g(shù)在組織工程中的應(yīng)用主要是將目標(biāo)誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)染到種子細(xì)胞里使誘導(dǎo)因子持續(xù)釋放，以滿足種子細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的需要。誘導(dǎo)因子是干細(xì)胞定向分化的決定性影響因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorp-hogenetic protein，BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

6、B超家族成員，目前已發(fā)現(xiàn)共有20多種亞型[8]，BMP-2是特異性的骨生長(zhǎng)因子，是目前已知能單獨(dú)誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)因子，也是公認(rèn)活性最強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)誘導(dǎo)因子之一。其基因重組產(chǎn)品rBMP-2是唯一獲美國(guó)食品藥物管理局批準(zhǔn)可用于臨床的成骨誘導(dǎo)因子。但這種外源性誘導(dǎo)因子rBMP-2具有諸多弊端，如易擴(kuò)散、降解快、半衰期較短、用量大、價(jià)格昂貴等[9]，極大地影響其成骨效應(yīng)的發(fā)揮，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)通過BMP-2基因

7、修飾種子細(xì)胞，使其內(nèi)源性地表達(dá)，從而克服上述缺點(diǎn)，可望解決骨組織工程的難題之一一誘導(dǎo)因子問題[10]
　　 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用涉及到一個(gè)關(guān)鍵的問題是如何選擇合適的基因轉(zhuǎn)染載體。目前常用的轉(zhuǎn)基因載體包括病毒載體和非病毒轉(zhuǎn)基因載體兩大類。其中病毒載體在目前的科研工作和臨床試驗(yàn)中是主要使用的載體。但是病毒載體具有一些難以克服的缺陷，如制備復(fù)雜、靶向特異性差、高免疫原性、體內(nèi)不能重復(fù)使用、可能導(dǎo)致感染的潛在危險(xiǎn)和引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等，上述

8、這些缺陷，限制了以病毒載體在臨床上的實(shí)際應(yīng)用。所以近年來有越來越多的研究者將視線放在了非病毒載體上面[7]。非病毒載體具有成本低、制備相對(duì)簡(jiǎn)單、容易批量生產(chǎn)、攜帶遺傳物質(zhì)容量大、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，但也有轉(zhuǎn)基因效率相對(duì)低下、本身并無特異細(xì)胞或組織靶向性等缺點(diǎn)[8]。聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)是一種新的多聚陽離子型的基因載體，作為一種轉(zhuǎn)基因效率相對(duì)較高的非病毒載體，已經(jīng)成為非病毒載體領(lǐng)域衡量其他類型載體效率的一個(gè)“

9、金標(biāo)準(zhǔn)”[9]。本課題以PEI為基因轉(zhuǎn)染載體，ADSCs作為種子細(xì)胞，將誘導(dǎo)因子BMP-2基因轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞ADSCs中，使其持續(xù)分泌誘導(dǎo)因子BMP-2，進(jìn)而誘導(dǎo)種子向成骨細(xì)胞分化，為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨，治療骨缺損、骨不連等疾病奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題分三部分進(jìn)行。第一部分為兔脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的基本生物學(xué)特性及其多向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究。對(duì)ADSCs進(jìn)行體

10、外分離培養(yǎng)及傳代擴(kuò)增，探討兔ADSCs理想的體外培養(yǎng)方法;觀察其原代及傳代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)，探討ADSCs生物學(xué)特性;對(duì)其表型特征進(jìn)行鑒定，以及體外傳代培養(yǎng)和成骨分化誘導(dǎo)對(duì)其表型的影響。探討體外傳代培養(yǎng)對(duì)ADSCs增殖分化及凋亡的影響。對(duì)第3、6代ADSCs行成脂、成骨誘導(dǎo)分化，評(píng)價(jià)ADSCs多向分化潛能，進(jìn)一步確認(rèn)其干細(xì)胞的屬性，并探討ADSCs體外定向誘導(dǎo)成骨分化潛能，為ADSCs作為骨組織工程種子細(xì)胞提供理論依據(jù)。
　　

11、 第二部分為PEI介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染兔ADSCs的實(shí)驗(yàn)研究。觀察PEI（13KDa，高分枝）對(duì)兔ADSCs的毒性大小，觀察PEI不同濃度、不同時(shí)間點(diǎn)下ADSCs存活率，對(duì)PEI作為ADSCs基因載體的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià);觀察PEI微粒、PEI和DNA混合物微粒的微觀形態(tài)，評(píng)估PEI與DNA質(zhì)粒的相容性，并探討PEI與DNA質(zhì)粒結(jié)合的最佳N/P比值（即PEI所含氨基氮與DNA所含磷酸基團(tuán)的摩爾數(shù)比）;檢測(cè)PEI介導(dǎo)增強(qiáng)綠色熒光蛋白(pEGFP)基

12、因轉(zhuǎn)染ADSCs的轉(zhuǎn)染效率，觀察不同N/P比值對(duì)轉(zhuǎn)染率的影響，探討獲得最高轉(zhuǎn)染的最佳N/P比值;從而評(píng)估PEI作為基因載體轉(zhuǎn)染ADSCs的可行性及效率，為ADSCs基因轉(zhuǎn)染尋找較為理想的基因轉(zhuǎn)染載體，為下一步ADSCs成骨研究提供理論依據(jù)。
　　 第三部分為PEI介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染兔脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。BMP-2是公認(rèn)的最強(qiáng)的也是唯一單獨(dú)誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨分化的細(xì)胞因子。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-BMP-2，以PEI為

13、基因載體介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后基因表達(dá)，分析PEI介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs的可行性、轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定表達(dá)、轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染對(duì)ADSCs生物學(xué)特性的影響，評(píng)估PEI為基因載體介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染ADSCs的成骨分化效果，為了進(jìn)一步研究非病毒載體PEI介導(dǎo)的BMP-2轉(zhuǎn)染ADSCs在動(dòng)物體內(nèi)成骨修復(fù)的作用，從而探討利用基因技術(shù)在骨組織工程種子細(xì)胞自身表達(dá)細(xì)胞因子BMP-2誘導(dǎo)下兔脂肪干細(xì)胞成骨分化的效果，為進(jìn)一步構(gòu)

14、建組織工程骨，治療骨缺損、骨不連等疾病奠定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分兔脂肪干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性及其多向誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其基本生物學(xué)特性，并對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定，分析其作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。
　　 方法:從成年日本大耳白兔的頸背部分離脂肪組織，通過Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代ADSCs并培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％融合時(shí)傳代，用倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情

15、況和形態(tài)特征，研究其增殖過程，描繪其生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD34、CD44、CD45的表達(dá)及其變化，分析其表型特征;將ADSCs行成骨和成脂誘導(dǎo)，分別通過ALP、茜素紅、VonKossa（鈣結(jié)節(jié)）染色和油紅o染色檢測(cè)ADSCs成骨分化潛能和成脂分化潛能，未誘導(dǎo)組作為對(duì)照組。
　　 結(jié)果:體外培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞呈梭形纖維樣細(xì)胞形態(tài)，增殖活躍，傳代后形態(tài)均一，多次傳代后細(xì)胞仍保持較強(qiáng)增殖能力，生長(zhǎng)曲線呈“

16、S”型。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3、6代ADSCs均高表達(dá)CD29、CD44，陽性率超過90％;低表達(dá)CD34、CD45陽性率不超過5％，且CD29、CD44隨著傳代表達(dá)逐漸增高，CD34、CD45隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低。成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶、茜素紅、vonKossa染色陽性，成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組油紅o染色陽性，對(duì)照組均為陰性。
　　 結(jié)論:
　　 兔脂肪干細(xì)胞在體外易于分離培養(yǎng)，保持穩(wěn)定增殖，并表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表型

17、，特定條件下可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。有望成為骨組織工程理想的種子細(xì)胞。
　　 第二部分聚乙烯亞胺介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染兔脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:探討非病毒載體聚乙烯亞胺（PEI，13KDa，分支型）作為載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染月旨肪干細(xì)胞的可行性。
　　 方法:檢測(cè)不同濃度下PEI對(duì)脂肪干細(xì)胞的毒性。以PEI為載體，不同N/P值下將增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后48 h小時(shí)轉(zhuǎn)染效果，計(jì)

18、算各N/P值下的轉(zhuǎn)染效率，并以lipofectamine2000轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組。
　　 結(jié)果:當(dāng)PEI濃度在50μg/ml以內(nèi)，其對(duì)脂肪干細(xì)胞的毒性極小，細(xì)胞存活率90％以上，濃度100μg/ml以上時(shí)，PEI細(xì)胞毒性明顯增加;不同的N/P值轉(zhuǎn)染效率不同，當(dāng)N/P＜6，比值增大轉(zhuǎn)染效率隨之增高;當(dāng)N/P值為6時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高，此后轉(zhuǎn)染效率隨比值的升高而下降。
　　 結(jié)論:PEI是一種低價(jià)、安全、實(shí)用、高效率的基因轉(zhuǎn)染載體，

19、可用于脂肪干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染。
　　 第三部分聚乙烯亞胺介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因轉(zhuǎn)染兔脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究目的:分析聚乙烯亞胺作為載體介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的基因表達(dá)，評(píng)估轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的成骨分化效果。
　　 方法:取成年日本大耳白兔的頸部脂肪，經(jīng)體外分離培養(yǎng)的方法獲得ADSCs，并對(duì)其進(jìn)行表型鑒定，明確其脂肪干細(xì)胞的屬性，用聚乙烯亞胺介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染至脂肪干細(xì)胞，G-418篩

20、選獲得陽性細(xì)胞克隆。RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)，ELISA法BMP-2蛋白表達(dá)分泌，western-bloting法檢測(cè)骨鈣素和Ⅰ膠原蛋白的含量，堿性磷酸酶定量檢測(cè)，并行茜素紅染色，未轉(zhuǎn)染組作對(duì)照。
　　 結(jié)果:從兔脂肪組織中分離出來的第3、6代ADSCs均高表達(dá)CD29、CD44，陽性率超過90％;低表達(dá)CD34、CD45陽性率不超過5％，且CD29、CD44隨著傳代表達(dá)逐漸增高，CD34、CD45隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸