蒙古牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）基因克隆和組織表達(dá)研究.pdf

1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和生長(zhǎng)分化因子(GDFs)是TGF-β超家族的重要成員，它們對(duì)動(dòng)物繁殖性能有重要作用，特別是對(duì)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和動(dòng)物生殖功能起重要的調(diào)節(jié)作用。故對(duì)BMPs及其受體的分子克隆和不同組織表達(dá)進(jìn)行研究，以期確定BMPs及其受體在牛不同生殖發(fā)育階段所起的作用，并從基因角度上闡明不孕或多胎產(chǎn)生的機(jī)制。本研究在其他哺乳動(dòng)物(人、綿羊、豬、小鼠、雞等)骨形態(tài)發(fā)生蛋白研究基礎(chǔ)上，首先采用RT-PCR.技術(shù)克隆了與蒙古牛繁殖性狀相

2、關(guān)的四種基因，利用生物信息學(xué)的方法對(duì)這四種基因的分子特征和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，然后利用半定量RT-PCR方法和原位雜交技術(shù)在mRNA水平上檢測(cè)了四種基因在蒙古牛的卵巢、子宮、輸卵管和腎臟組織的表達(dá)情況。通過上述方法獲得如下試驗(yàn)結(jié)果: 1、采用RT-PCR方法從牛卵巢組織中擴(kuò)增出四種與繁殖性狀相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，分別為BMP15、BMPR-IB、GDF9和BMP4基因的eDNA序列。經(jīng)鑒定和序列分析，四種基因序列與己知

3、動(dòng)物的相應(yīng)序列有較高的同源性，符合TGF-β家族成員的特征。 2、應(yīng)用生物信息學(xué)的方法分析了蒙古牛BMPl5基因的CDS區(qū)、BMPR-IB和BMP4基因3 端序列，其中BMP15 CDS區(qū)全長(zhǎng)1185bp，由兩個(gè)外顯子組成，編碼394個(gè)氨基酸。該序列已提交GenBank，序列號(hào)為:DQ463368；BMPR-IB基因序列3'端長(zhǎng)953bp，編碼302個(gè)氨基酸。該基因序列已提交GenBank，序列號(hào)為DQ489533；利用RACE

4、技術(shù)擴(kuò)增了牛BMP4基因3'端全部序列，序列長(zhǎng)1306bp，編碼389個(gè)氨基酸，其中包括3'末端非翻譯區(qū)長(zhǎng)為121bp和PolyA15個(gè)堿基。此序列已登陸GenBank，序列號(hào):AY854957；克隆了牛GDF9基因保守區(qū)域，序列長(zhǎng)264bp。 3、利用生物信息學(xué)方法和相關(guān)軟件分析了牛BMPl5、BMPR-IB和BMP4基因的同源性，試驗(yàn)結(jié)果表明牛BMPl5基因核苷酸序列和綿羊的同源性為98.5％，與豬的同源性為87.6％，與斑

5、馬魚的同源性為29.1％；通過預(yù)測(cè)牛BMPl5蛋白質(zhì)保守區(qū)域，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)保守區(qū)域，在291～394氨基酸處，是TGF-B超家族成員所共有的同源或異源結(jié)構(gòu)域，牛BMP15氨基酸序列存在4個(gè)功能位點(diǎn)。 牛BMPR-IB基因編碼302氨基酸，此序列與人及禽類的核苷酸序列有很高的保守性，根據(jù)牛BMPR-IB eDNA推測(cè)的氨基酸序列與已知綿羊、山羊、人、猴子、豬、雞等典型的真核生物氨基酸序列同源性均達(dá)到90％以上。 對(duì)牛BMP

6、4基因序列分析表明，該基因eDNA序列包含有1170bp編碼區(qū)，3'端氨基酸序列含有BMP家族固有特定位置的7個(gè)半胱氨酸，并與人、綿羊、小鼠、大鼠、狗和雞的核苷酸序列同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的同源性分別為90.2％、94.2％、90.9％、90.4％、85.4％和73.6％。 4、通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了四種基因的mRNA在牛卵巢、子宮、輸卵管和腎臟組織部位的表達(dá)情況。四種基因在牛卵巢、子宮、輸卵管和腎臟組織中均有表達(dá)，只是不同基因