人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2真核表達(dá)質(zhì)粒的制備、轉(zhuǎn)染及表達(dá).pdf

1、目的：探討B(tài)MP-2轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件和方法，制備含人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(hBMP-2)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中使之穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2。獲得可穩(wěn)定高效表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，為最終臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為探索組織工程化骨的構(gòu)建方法提供新思路。 方法：實(shí)驗(yàn)分2組，A組：空白組(未做基因轉(zhuǎn)染)；B組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染BMP-2基因組)。1、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增出hBMP-2目的DNA

2、片段。通過連接酶連入真核質(zhì)粒pcDNA3.1中，經(jīng)大腸桿菌JM109.2擴(kuò)增和篩選，構(gòu)建出重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1-hBMP-2。2、通過脂質(zhì)體法將所得到的重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞中，用G418進(jìn)行梯度篩選，從而獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的細(xì)胞克隆。3、采用逆轉(zhuǎn)錄酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)培養(yǎng)MSCs中hBMP-2mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1、重組質(zhì)粒通過EcoRI酶切后，電泳圖示約1.5kb的hBMP-2的目的片