大鼠鈍性脊髓損傷后骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）的表達(dá)分布及作用.pdf

1、脊髓損傷修復(fù)是目前神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域最重要的課題之一。脊髓損傷的病理生理改變由原發(fā)性損傷及一系列的繼發(fā)性損傷所致，導(dǎo)致的功能結(jié)局主要是運(yùn)動(dòng)功能減退或完全喪失，感覺功能的異常如神經(jīng)性疼痛的發(fā)生發(fā)展。研究表明，脊髓損傷后導(dǎo)致?lián)p傷局部及相鄰部位的膠質(zhì)細(xì)胞興奮激活，即反應(yīng)性膠質(zhì)炎，并導(dǎo)致膠質(zhì)疤痕形成，膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕是軸突再生的重要屏障，它影響軸突再生、髓鞘再形成與突觸再建立，是脊髓損傷后感覺與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能障礙的重要原因之一。但是，對(duì)于調(diào)控脊髓損

2、傷后膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕發(fā)生發(fā)展的體內(nèi)機(jī)制尚不清楚。 在胚胎發(fā)育期，一些決定細(xì)胞命運(yùn)的基因如Numb、Notch-1、Shh、BMPs等表達(dá)豐富，但成年后大多數(shù)減弱或功能處于靜止?fàn)顟B(tài)。組織損傷后，一些基因又重新表達(dá)或表達(dá)發(fā)生改變。組織損傷后的修復(fù)過(guò)程包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)至少部分地重演了發(fā)育時(shí)期的組織生成過(guò)程。因此，研究這些基因在脊髓損傷后的表達(dá)及功能意義對(duì)于闡明調(diào)控脊髓損傷修復(fù)的內(nèi)在機(jī)制具有重要意義。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(

3、Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族(transforming growth factor-β、TGF-β)成員。BMPs在骨骼的發(fā)育、骨形態(tài)的發(fā)生中起重要作用。同時(shí)，BMPs又具有廣泛的生物學(xué)活性，是多功能的蛋白質(zhì)。BMPs調(diào)控脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)形成和分化許多關(guān)鍵步驟，作用于神經(jīng)發(fā)育的不同階段，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同區(qū)域調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)、增殖與分化。不同的類型的BMP有不同的功能作用，BMP

4、2、4、7在膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育中起重要作用，它使神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，它誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的形成。但是BMPs在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如脊髓損傷中的作用的研究甚少。聯(lián)系BMPs及其受體在胚胎發(fā)育中的作用，推測(cè)BMP信號(hào)可能促進(jìn)脊髓損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)而促進(jìn)伴隨損傷出現(xiàn)的膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕的形成，因此可能成為調(diào)節(jié)脊髓損傷后膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕形成的重要細(xì)胞信號(hào)?；谝陨涎芯勘尘凹巴茰y(cè)，本研究將觀察脊髓損傷后BMP信號(hào)的表達(dá)及作用：首先，檢測(cè)B

5、MPs及其受體在正常成年大鼠脊髓中的表達(dá)分布；其次，檢測(cè)鈍性脊髓損傷后BMPs及其受體的表達(dá)改變：在上述研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用BMP阻斷劑Noggin局部顯微注射治療脊髓損傷，觀察脊髓膠質(zhì)反應(yīng)如對(duì)膠質(zhì)炎及膠質(zhì)活性的影響。本研究可能為探索脊髓損傷與保護(hù)機(jī)制并尋求有效的治療方法提供新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 針對(duì)這一研究目的，我們采用了下列研究方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)BMPs和其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子磷酸化的Smad蛋白(pSmad1/5/8)

6、及BMPs受體在正常成年大鼠脊髓中的表達(dá)分布；應(yīng)用Scheff SW描述的鈍性脊髓損傷動(dòng)物模型，采用免疫組織化學(xué)方法及West Blot方法，觀察脊髓損傷1、3、7、14、28、56天后，BMPs及其受體及pSmad1/5/8的表達(dá)分布；在上述研究基礎(chǔ)上，利用BMPs阻斷劑顯微注射至損傷的脊髓阻斷BMPs的作用，觀察膠質(zhì)活性的改變，并分析這些改變的可能意義。 研究結(jié)果顯示： 1．BMPs及其受體在成年大鼠脊髓的表達(dá)：

7、 免疫組化未檢測(cè)出BMP2、4在正常成年大鼠脊髓中表達(dá)，但BMP7在所有的少突膠質(zhì)細(xì)胞及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)。pSmad1/5/8在所有APC陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞核及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞核均表達(dá)。 BMPR Ia型受體在脊髓中央管室管膜細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，免疫雙標(biāo)顯示這些細(xì)胞是3CB2(放射狀膠質(zhì)的標(biāo)志)陽(yáng)性細(xì)胞。脊髓白質(zhì)周邊部位的部分3CB2陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Ia。在灰質(zhì)及白質(zhì)的少突膠質(zhì)細(xì)胞(APC陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Ia)及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(NeuN

8、陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Ia)，Ia有中等強(qiáng)度的表達(dá)。部分GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞及OX-42陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Ia。Ib型受體主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞、軸突及部分星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，中央管室膜細(xì)胞及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均不表達(dá)Ib。Ⅱ型受體在少突膠質(zhì)細(xì)胞及前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有表達(dá)，在部分星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。 2．BMPs及其受體在成年大鼠鈍性脊髓損傷后的表達(dá)： BMP2、4的表達(dá)：損傷3天后，在星形膠質(zhì)細(xì)胞即出BMP2、4的表達(dá)。損傷后7-14天，

9、損傷中心位置，在灰質(zhì)及殘余的白質(zhì)肥大的星形膠質(zhì)細(xì)胞體，出現(xiàn)BMP2、4最強(qiáng)表達(dá)，強(qiáng)表達(dá)持續(xù)到損傷后2個(gè)月。在距損傷中心頭、尾側(cè)0.5cm，仍有BMP2、4的較強(qiáng)表達(dá)。距損傷中心越遠(yuǎn)表達(dá)越弱。BMP7的表達(dá)：損傷1天后，星形膠質(zhì)細(xì)胞BMP7的表達(dá)明顯增加，損傷后14天表達(dá)激劇增多，高表達(dá)持續(xù)至損傷后1個(gè)月以上。而損傷后第一天，在少突膠質(zhì)細(xì)胞BMP7表達(dá)減少，但大多數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞仍表達(dá)BMP7，損傷后3天到28天，許多少突膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)BM

10、P7。pSmad1/5/8的表達(dá)：損傷后1天，大多數(shù)．APC陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)pSmad1/5/8，但是，一些APC陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)pSmad1/5/8。 損傷后7、14、28天，一些APC陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞仍不表達(dá)pSmad1/5/8，不表達(dá)pSmad1/5/8的少突膠質(zhì)細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、色變暗、甚至出現(xiàn)核分裂，提示這些細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征。 BMPs受體的表達(dá)：損傷后7、14、28、56天，在損傷中心及頭、尾側(cè)脊

11、髓白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)Ia，免疫雙標(biāo)顯示，3CB2陽(yáng)性的放射狀膠質(zhì)強(qiáng)表達(dá)Ia，3CB2陽(yáng)性細(xì)胞也是GFAP陽(yáng)性細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)Ia，而3CB2陰性GFAP陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)Ia。 3．Noggin明顯抑制脊髓損傷誘導(dǎo)的反應(yīng)性膠質(zhì)增生： 150kdynes IH脊髓損傷后3天，損傷部位局部注射Noggin一星期后，對(duì)脊髓組織學(xué)及免疫組化分析表明，應(yīng)用Noggin阻斷BMPs信號(hào)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，抑制Brdu陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量，

12、提示對(duì)損傷后的炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用。 綜合上述，我們得出以下主要研究結(jié)論： 1．雖然BMPs是一種在胚胎發(fā)育期豐富表達(dá)且決定細(xì)胞命運(yùn)的基因，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成年大鼠的脊髓中，BMP2、4、7、pSmad1/5/8和BMPR均有表達(dá)。這些蛋白表達(dá)保留至成年期，可能在組織損傷時(shí)重現(xiàn)胚胎期的表達(dá)特征和功能，即可能參與組織損傷機(jī)制，也可能啟動(dòng)修復(fù)程序。 2．鈍性脊髓損傷后，隨著膠質(zhì)炎及膠質(zhì)疤痕形成，BMP2、4、7

13、及其受體在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)激劇上升，表明BMP信號(hào)系統(tǒng)可能促進(jìn)炎性反應(yīng)，抑制神經(jīng)軸突再生而導(dǎo)致神經(jīng)功能異常。 3．BMP信號(hào)的拮抗劑Noggin注射至損傷的脊髓局部阻斷BMP信號(hào)，可明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CSPG-versicon，并抑制其炎癥反應(yīng)及星形膠質(zhì)增生反應(yīng)，將可能有助于軸突的再生，為神經(jīng)功能恢復(fù)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 4．綜合本研究結(jié)果，BMPs及其受體的表達(dá)保留至成年期，且在脊髓鈍性損傷后表達(dá)增強(qiáng)，而以其拮抗劑

14、阻斷信號(hào)表達(dá)可明顯抑制其炎癥反應(yīng)，表明BMP信號(hào)是參與脊髓的損傷與修復(fù)機(jī)制，從而提示，調(diào)節(jié)BMPs及其受體的表達(dá)或控制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將成為治療脊髓損傷的重要途徑，為進(jìn)一步脊髓損傷研究提供了方向。 未來(lái)的方向： 基于以上研究結(jié)果，調(diào)節(jié)BMPs及其受體的表達(dá)或控制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將成為治療脊髓損傷的重要途徑，為進(jìn)一步脊髓損傷研究提供了方向。同時(shí)，將密切結(jié)合本學(xué)科有關(guān)疼痛治療，運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)等的治療進(jìn)展，不僅可以更明確闡明BMPs及其受體