重組人促紅素異構(gòu)體分析及報(bào)告基因法測定其生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、人促紅素（Erythropoietin，EPO)是一種刺激紅細(xì)胞生成的糖蛋白激素，由腎臟合成分泌，作用于骨髓，刺激紅細(xì)胞的生成。重組人促紅素（rHuEPO）是一種應(yīng)用基因工程技術(shù)將人 EPO基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，高效表達(dá)的能夠刺激紅細(xì)胞生成的糖蛋白，主要用于治療慢性腎功能衰竭和癌癥化療產(chǎn)生的貧血。
　　rHuEPO的分子骨架是由165個(gè)氨基酸組成的肽鏈，肽鏈上有3個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)和1個(gè)O-連接的糖基化位點(diǎn)，完整的EPO分子

2、中糖基部分高達(dá)相對(duì)分子量的40％。rHuEPO的生物學(xué)活性不僅與氨基酸序列有相關(guān)性，而且與蛋白的糖基化程度密切相關(guān)。糖鏈的完整性直接決定 rHuEPO在體內(nèi)的穩(wěn)定性和活性，特別是糖鏈末端的唾液酸殘基對(duì)rHuEPO的體內(nèi)生物學(xué)至關(guān)重要。但是在實(shí)際生產(chǎn)過程中，宿主細(xì)胞、生產(chǎn)發(fā)酵和分離純化工藝會(huì)影響 rHuEPO的糖基化程度，進(jìn)而影響 rHuEPO產(chǎn)品的質(zhì)量?，F(xiàn)在國內(nèi)外沒有統(tǒng)一糖的分析手段，測定糖蛋白異構(gòu)體的方法主要有毛細(xì)管電泳（CE)、等電

3、聚焦(IEF)、SDS-PAGE電泳技術(shù)和離子色譜技術(shù)（HPAEC)。
　　論文第一部分建立了一種新的rHuEPO異構(gòu)體分析方法，即成像毛細(xì)管等電聚焦法，對(duì)HuEPO樣品的異構(gòu)體進(jìn)行分析，該方法較平板等點(diǎn)聚焦法而言，重復(fù)性好，耗時(shí)短，操作簡單。同時(shí)我們也測定 rHuEPO糖鏈的結(jié)構(gòu)和組成，分析糖鏈和異構(gòu)體與生物活性之間的相關(guān)性，為rHuEPO的質(zhì)控提供指導(dǎo)。
　　論文第二部分則對(duì)rHuEPO的活性檢測新方法的研究，即報(bào)告基因

4、法測定重組人促紅素生物活性的初步研究。現(xiàn)在 rHuEPO活性檢測方法主要有兩種：網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法和UT-7/EPO細(xì)胞法。應(yīng)用網(wǎng)織紅細(xì)胞法測定 rHuEPO的生物學(xué)活性，有明顯的缺陷，需要使用動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)周期長，并且存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性不太理想。雖然 EPO依賴株 UT-7細(xì)胞法較網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法操作簡單，成本較低，不能精確定量。
　　隨著報(bào)告技術(shù)的的發(fā)展成熟和EPO信號(hào)通路闡明，使得我們能夠利用這些成功建立 EPO

5、活性測定的新方法。EPO信號(hào)通路中比較復(fù)雜，在 UT-7細(xì)胞中，JAK2/STAT5、RAS/MAPK通路均可以激活并并 bcl-xl基因的表達(dá)。熒光素酶是高靈敏的報(bào)告基因。在本文中，我們將 bcl-xl啟動(dòng)子基因插入到含有熒光素酶基因的PGL4.17質(zhì)粒上，成功構(gòu)建了含有bcl-xl啟動(dòng)子的熒光報(bào)告質(zhì)粒 P1和P2。我們將構(gòu)建的報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于293細(xì)胞，初步測定這兩個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒是有活性的。我們將熒光報(bào)告基因質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染于 UT-7