豬白細胞介素15基因的克隆、表達及其生物活性初步測定.pdf

1、白細胞介素15(IL-15)是與白細胞介素2(IL-2)有相似生物學活性，但無序列同源性的新細胞因子，其體內分布遠較IL-2廣泛，在免疫調節(jié)和免疫應答尤其是在抗腫瘤免疫應答中有重要作用。1997年發(fā)現的豬白細胞介素15(porcine interleukin-15，pIL-15)是與一種人IL-15活性相似的細胞因子。 根據Genbank已發(fā)表的豬IL-15基因序列(NM214390)設計并合成了特異性引物，無菌采取榮昌豬前腔靜

2、脈血，分離出淋巴細胞，經刀豆蛋白A(ConA)誘導后提取的總RNA為模板，應用RT-PCR方法對豬IL-15基因開放閱讀框(ORF)克隆、序列測定及生物信息學分析。結果發(fā)現pIL-15 ORF由489個核苷酸組成，推測其編碼產物由162個氨基酸組成。核苷酸序列分析比對顯示，榮昌豬IL-15與Genbank已發(fā)表的pIL-15序列的核苷酸、氨基酸同源性很高，均為99.4％，與人、獼猴、牛、綿羊、犬、貓的核苷酸同源性為84.1％～89.8％

3、，與小鼠的同源性為77.4％，與雞的同源性僅為27.8％，與人、獼猴、牛、綿羊氨基酸同源性均在80.0％以上，與雞的同源性僅為34.8％。結構域分析發(fā)現，pIL-15與pIL-2結構有很大的相似性。系統進化樹則表明豬IL-15與哺乳動物親緣關系較近，與雞進化關系較遠。 研究發(fā)現，IL-15的分泌受到多種因素的調控。其中，IL-15的長信號肽是影響IL-15蛋白分泌的主要因素，本實驗借鑒人IL-15體外表達的經驗，除去了含有48個

4、氨基酸殘基的信號肽。應用PCR技術擴增出榮昌豬IL-15成熟肽基因，進行pMD18-T載體克隆，通過對質粒pMD18-T-IL-15及pET-32a(+)進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切、連接，將pIL-15基因定向插入 pET-32a(+)，經雙酶切和 PCR 鑒定表明，成功構建重組表達質粒pET-32-pIL-15，并轉化入表達宿主菌BL21(DE3)，用IPTG進行誘導表達，SDS-PAGE分析表明，表達產物以融合表達的包涵體形式存