重組人促紅素的生產(chǎn)工藝研究.pdf

1、20世紀(jì)50年代初人們就認(rèn)識到腎臟可以產(chǎn)生一種激素，刺激紅細(xì)胞生長，稱為促紅細(xì)胞生成素（簡稱EPO），主要由腎臟近曲小管附近的細(xì)胞合成和分泌，它的基本生理功能是刺激骨髓紅細(xì)胞的生成和釋放，由于紅細(xì)胞沒有細(xì)胞核、線粒體、核糖體等細(xì)胞成分，不能通過自身分裂增殖，因此“自身生成促紅素”是人體產(chǎn)生紅細(xì)胞的唯一途徑。而人體中EPO是作為促使造血干細(xì)胞生成的重要部分，其含量的多少直接影響紅細(xì)胞生成的數(shù)量。
　　 1985年科學(xué)家應(yīng)用人工重組

2、方法合成了EPO，稱為重組人促紅素(rhEPO)。至今已廣泛應(yīng)用于各型腎臟病貧血患者的治療并取得十分滿意的結(jié)果。自1997年國內(nèi)開始自主生產(chǎn)重組人促紅素以來，質(zhì)量得到了不斷提高，與進(jìn)口產(chǎn)品的差距也越來越小，但隨著產(chǎn)品市場價(jià)格的不斷降低，消費(fèi)者對質(zhì)量要求的不斷提高，需要對生產(chǎn)工藝進(jìn)行進(jìn)一步摸索、優(yōu)化，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，降低生產(chǎn)成本。
　　 目的：
　　 本研究以重組人促紅素為研究對象，分析重組人促紅素的質(zhì)量情況，并采

3、取有效手段對重組人促紅素的質(zhì)量情況進(jìn)行監(jiān)控。同時(shí)對生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到提高質(zhì)量、降低成本的目的。
　　 方法：
　　 1.重組人促紅素質(zhì)量情況的檢測通過對樣品的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行生物學(xué)活性（體內(nèi)比活性）、免疫學(xué)活性（體外比活性）、唾液酸含量測定和等電聚焦分析，找出幾項(xiàng)檢測指標(biāo)的關(guān)系，進(jìn)而為快速檢測產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。有利于在產(chǎn)品工藝改進(jìn)中檢測產(chǎn)品的質(zhì)量情況。
　　 2.細(xì)胞擴(kuò)增期血清的篩選實(shí)驗(yàn)通過在rhEPO生產(chǎn)種

4、子細(xì)胞擴(kuò)增階段進(jìn)行培養(yǎng)基中不同類型血清的選擇實(shí)驗(yàn)，擺脫生產(chǎn)血清依賴進(jìn)口的胎牛血清的現(xiàn)狀。
　　 3.細(xì)胞擴(kuò)增期添加因子及其比例的篩選通過在rhEPO生產(chǎn)種子細(xì)胞擴(kuò)增階段添加不同氨基酸，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，篩選適合細(xì)胞生長的氨基酸。
　　 利用篩選的類胎牛血清添加不同濃度合適的氨基酸類型，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增階段不同氨基酸及其濃度的選擇。
　　 4.維持期無血清培養(yǎng)基的篩選在維持階段細(xì)胞培養(yǎng)中添加血清會給后續(xù)純化過程帶來諸多

5、不便，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，無血清培養(yǎng)基逐漸成為細(xì)胞培養(yǎng)中的主流。本實(shí)驗(yàn)通過篩選不同廠家無血清培養(yǎng)基，并對細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行檢測，確定最適合本單位細(xì)胞生長的無血清培養(yǎng)基。
　　 5.連續(xù)培養(yǎng)期收獲最佳溫度的篩選細(xì)胞培養(yǎng)的維持階段是細(xì)胞分泌代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵階段，通過摸索細(xì)胞收獲階段的最佳條件，嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度，保證產(chǎn)品收率。
　　 6.不同階段中間體穩(wěn)定性的考察對生產(chǎn)工藝不同步驟獲得的中間體：收液、反相前中間體、DEAE收液分別

6、放置不同時(shí)間后，進(jìn)行相應(yīng)后續(xù)的純化過程，得到原液后測定其唾液酸含量、生物學(xué)活性，考察存放時(shí)間對糖基化的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.重組人促紅素質(zhì)量的檢測方法研究通過相關(guān)性的分析，唾液酸與體內(nèi)比活性顯著相關(guān)，而與體外比活性不相關(guān).同樣體內(nèi)比活性與體外比活性在唾液酸含量低時(shí)也不相關(guān)，而在唾液酸含量高時(shí)也有一定的相關(guān)性。同時(shí)唾液酸含量和IEF有一定相關(guān)性，IEF圖譜中酸性帶多的唾液酸含量高。因此可以用唾液酸含量及等電聚焦的

7、測定代替耗時(shí)長、誤差大的體內(nèi)比活性測定，從而快速反映制品的質(zhì)量水平。
　　 2.細(xì)胞擴(kuò)增期血清的篩選實(shí)驗(yàn)本部分通過對細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增時(shí)期的血清進(jìn)行了篩選，選擇出了與進(jìn)口胎牛血清相似的國產(chǎn)類胎牛血清。作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。
　　 3.細(xì)胞擴(kuò)增期添加因子及其比例的篩選結(jié)合上一部分實(shí)驗(yàn)的成果，通過篩選在培養(yǎng)基中加入氨基酸類型及加入濃度，篩選出的氨基酸為絲氨酸，用量為0.05g/10L，配上選擇的類胎牛血清能在細(xì)胞擴(kuò)增期達(dá)到與進(jìn)口胎

8、牛血清類似的效果。為降低血清成本監(jiān)定基礎(chǔ)。
　　 4.維持期無血清培養(yǎng)基的篩選通過對細(xì)胞維持培養(yǎng)期進(jìn)行無血清培養(yǎng)基的篩選。選擇出EXCELL-302是較適合本公司細(xì)胞生長的。
　　 5.連續(xù)培養(yǎng)期收獲最佳溫度的篩選通過對細(xì)胞維持期培養(yǎng)溫度的選擇，發(fā)現(xiàn)37℃條件下更有利于CHO細(xì)胞的生長與產(chǎn)物的分泌。
　　 6.中間體存放穩(wěn)定性的考察通過對不同中間體存放時(shí)間的考察，培養(yǎng)收液的中間體在放置2周后，反相層析前中間體在放

9、置1周后；DEAE前中間體在放置2天后再進(jìn)行純化所得原液的質(zhì)量將受到很大影響。
　　 結(jié)論：
　　 在rhEPO的檢驗(yàn)中，由于體內(nèi)活性與唾液酸和含量有一定的相關(guān)性，而唾液酸含量也能在等電聚焦圖譜中得到體現(xiàn)，因此可以用唾液酸含量、等電聚焦來快速反應(yīng)制品某些方面的質(zhì)量。
　　 在細(xì)胞擴(kuò)增階段可以用國產(chǎn)類胎牛血清結(jié)合一定濃度的氨基酸來代替進(jìn)口胎牛血清進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；且在細(xì)胞維持培養(yǎng)期培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度對產(chǎn)品質(zhì)量和收率有重要