重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8a生產(chǎn)工藝及藥效學(xué)初探.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8a (fibroblast growth factor 8,FGF8)作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族(fibroblast growth factor family,FGFs家族)的第8個(gè)成員的a亞型,它具有一般家族成員的作用：促進(jìn)軟骨形成、活化上皮細(xì)胞、促進(jìn)傷口愈合等,同該家族的其他成員相比,FGF8a有望成為既刺激正常細(xì)胞分化,又無誘導(dǎo)癌變之虞的新一代細(xì)胞生長(zhǎng)因子。FGF8a用藥的有效性和安全性成為全球研究的焦點(diǎn)。本

2、研究首先在搖瓶實(shí)驗(yàn)中摸索發(fā)酵基本條件,從培養(yǎng)基pH值、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、IPTG誘導(dǎo)終濃度和誘導(dǎo)溫度四個(gè)影響因素做“四因素四水平”正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),找出最適發(fā)酵工藝參數(shù)。然后根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往經(jīng)驗(yàn)控制發(fā)酵參數(shù),進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后離心收菌,進(jìn)行SDS-PAGE分析目的蛋白含量。純化過程中對(duì)前期的方法進(jìn)行優(yōu)化,簡(jiǎn)化蛋白復(fù)性操作。然后采用MTT法檢測(cè)rhFGF8a蛋白活性,計(jì)算出蛋白生物學(xué)活性。在藥效學(xué)方面,首先進(jìn)行雞胚尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn),

3、觀察rhFGF8a在誘發(fā)CAM血管生成的能力；然后研究rhFGF8a與間隙連接蛋白抑癌基因Cx43的關(guān)系,通過western blotting印跡分析觀察rhFGF8a能否獨(dú)立上調(diào)Hela細(xì)胞Cx43蛋白的表達(dá)。研究表明,搖瓶正交實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)參數(shù)組合為培養(yǎng)基pH值7.0,IPTG誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD600值為0.5, IPTG終濃度為0.5mM、誘導(dǎo)溫度30℃。在發(fā)酵過程中,參數(shù)控制為：(1)空氣流量初始設(shè)定為10L/min,誘導(dǎo)后升為15L/

4、min,溶氧控制在40%；(2)溫度初始為37℃,誘導(dǎo)時(shí)降到30℃；(3)pH值設(shè)定為7.0；(4)攪拌速度：設(shè)定攪拌速度下限為105rpm,上限為500 rpm；(5)補(bǔ)料：在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h后開始勻速補(bǔ)料250ml/h。發(fā)酵結(jié)束收獲菌體20g/L,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析目的蛋白rhFGF8a表達(dá)量占菌體總蛋白的30%左右。優(yōu)化蛋白純化條件,蛋白復(fù)性所需的氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽用量減少至原來的1/10,尿素濃度從4M梯