重組人白細胞介素-1受體拮抗劑的表達、復(fù)性、純化及中試生產(chǎn)工藝研究.pdf

1、現(xiàn)代生物技術(shù),幾乎使人們可以獲得任何需要的蛋白,用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究。然而,要利用這一技術(shù)獲得大量的能夠滿足產(chǎn)業(yè)化需要、質(zhì)量符合臨床要求的藥用蛋白,卻面臨巨大的挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)的復(fù)性和純化,作為生物工程下游技術(shù)的重要部分,往往是以大腸桿菌為表達系統(tǒng),生產(chǎn)特定蛋白藥物的瓶頸。白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1ra)為白細胞介素-1(IL-1)家族的一員,能特異性地與IL-1受體結(jié)合,從而拮抗IL-1的各種生物學(xué)效應(yīng)。在臨床上廣泛用于治療I

2、L-1參與病理變化過程的一些相關(guān)疾病。IL-1ra臨床用量很大,每劑量高達100mg。但目前為止,國內(nèi)還沒有IL-1ra產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報道。因此本研究對重組IL-1ra中試生產(chǎn)工藝進行研究。首次成功地在中試規(guī)模下,將復(fù)性原理應(yīng)用于IL-1ra包涵體復(fù)性,實現(xiàn)復(fù)性純化同步完成,復(fù)性率達到70％,產(chǎn)物得率達到65%,比國內(nèi)外最好產(chǎn)率提高3.7倍。這對于國內(nèi)重組蛋白藥物的產(chǎn)業(yè)化工藝研究具有重要的參考價值。本文主要研究結(jié)果如下:1.根據(jù)GenBa

3、nk中人類IL-1ra基因序列(GenBank登錄號: EF140714),兼顧稀有密碼子和大腸桿菌密碼子偏好性,改造編碼序列,人工合成hIL-1ra成熟蛋白cDNA編碼序列。構(gòu)建原核表達載體pLY-hIL-1ra。通過對表達量和遺傳穩(wěn)定性的篩選,確定BL21為最適宿主菌,并成功構(gòu)建工程菌株BL21/pLY-hIL-1ra。2.在揺瓶條件下對工程菌株BL21/pLY-hIL-1ra發(fā)酵條件進行初步摸索,確定最佳誘導(dǎo)時機為生長中期,誘導(dǎo)溫

4、度42℃,誘導(dǎo)時間為4h。在此基礎(chǔ)上,進一步用3.7L發(fā)酵罐,對實驗室條件下發(fā)酵工藝條件進行優(yōu)化。確定的工藝條件為:①用半合成培養(yǎng)基,以甘油作為碳源,采用溶氧反饋分批補料培養(yǎng)方法進行發(fā)酵;②25%濃氨水調(diào)節(jié)pH維持在7.0左右,30℃培養(yǎng)5小時后,開始以脈沖方式流加補料液,通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、進氣量、罐壓、補料速度控制溶氧大于30%;③接種10小時后,升溫到42℃,誘導(dǎo)4小時,菌體濕重達到58 g/L,表達量38%。將此工藝放大到30L發(fā)酵罐

5、,菌體濕重可達60 g/L,重組蛋白質(zhì)的表達量為34%。表明該工藝條件適合工程菌株的高密度發(fā)酵,達到了中試規(guī)模要求。3.在實驗室規(guī)模下,對重組IL-1ra包涵體釋放、洗滌和溶解條件進行初步研究。以獲得的參數(shù)作為參考,放大到中試規(guī)模。確定中試規(guī)模條件為:①菌體破碎。高壓勻漿破碎菌體,菌體(g):緩沖液(ml)=1:10,壓力40M Pa,循環(huán)4次;破菌率可達96%,一次處理濕菌體量1000g,可獲得粗包涵體約250g;緩沖液組成:20 m

6、mol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,pH8.0。②包涵體洗滌。洗滌分4步進行,洗滌緩沖液(ml):粗包涵體(g)=10:1,在攪拌罐內(nèi)混懸,轉(zhuǎn)速控制在200 rpm,每個洗滌步驟洗滌30min,目標(biāo)蛋白的純度可達72%。洗滌緩沖液組成:第一次為20 mM Tris-HCl,5mM EDTA, pH8.0;第二次為20 mM Tris-HCl,5mM EDTA,100 mM NaCl,1%TritonX-100,1M

7、尿素,pH8.0;第三次為20 mM Tris-HCl,5mM EDTA,1%TritonX-100,100 mM NaCl,pH8.0;第四次為20 mM Tris-HCl,5 mM EDTA,pH8.0。③包涵體溶解。溶解緩沖液(ml):包涵體(g)=20:1,溶解時間6h,溫度為室溫,同時進行攪拌,轉(zhuǎn)速為200 rpm。溶解緩沖液組成:20 mM Tris-HCl,5 mM EDTA,5 mM DTT,6M尿素,pH8.0。4.在

8、實驗室規(guī)模條件下,對IL-1ra包涵體色譜復(fù)性及純化條件進行研究,實現(xiàn)復(fù)性和純化同步完成。條件為:選擇Q-Sepharose Fast Flow陰離子色譜;復(fù)性溫度10℃,pH8.0;尿素濃度梯度為6mol/L降到2.1mol/L時,復(fù)性緩沖液用量4倍柱體積;線性流速為0.565cm/min;負載量為200ml,含目標(biāo)蛋白約1024mg;pH6.5條件下梯度洗脫,流速控制在6.0 ml/min,NaCl濃度由0到0.4M的時間控制在50

9、min。在此條件下,蛋白收率約70%,樣品生物比活性達到10萬單位/mg,與Sigma公司銷售的對照品一致,純度達98%以上。以實驗室條件作為參照,將此工藝成功放大到中試規(guī)模。選擇BPGTMΦ70mm×L500mm色譜柱,流速控制在0.754 cm/min,在復(fù)性溫度、pH等與實驗室規(guī)模一致的條件下,負載量增加到2000ml包涵體溶液,含目標(biāo)蛋白約10240mg,目的蛋白回收率65%,純度98%,生物比活性達到10萬單位/mg,與對照品

10、一致,每升發(fā)酵液純品產(chǎn)率為890mg。表明此工藝到達中試規(guī)模要求。5.內(nèi)毒素去除。選用SP-Spharose Fast Flow強陽離子交換色譜,讓內(nèi)毒素直接穿出色譜介質(zhì),而樣品仍保留在色譜介質(zhì)上。通過進一步改變pH,讓目標(biāo)蛋白解吸下來,達到去除內(nèi)毒素的目的,同時去除復(fù)性純化樣品中殘留的尿素。在實驗室條件基礎(chǔ)上,將此工藝成功放大到中試規(guī)模,單次處理量達到6.7g目的蛋白,內(nèi)毒素由200EU/mg-260EU/mg降低到小于0.5EU/m

11、g,滿足了安全用藥的要求,回收率為93%。6.初步建立了原液的穩(wěn)定性條件。20℃條件下,通過研究pH和保護劑濃度等因素對目的蛋白穩(wěn)定性的影響,確定了保存目的蛋白活性的適宜條件為:pH6.5,蔗糖濃度為1.8%。7.對原液的質(zhì)量進行了鑒定和檢測。①理化鑒定:用MADLI-TOF MS法,進行分子量的測定,復(fù)性純化后的rhIL-1ra分子量為17.224kD,與理論分子量一致;肽圖分析和West-Blotting免疫特異性分析及N端15個氨