重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠視神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠視神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究姓名：王輝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：劉哲麗20080401方 法1 、R G C s 體外培養(yǎng)，分為實(shí)驗(yàn)組( r h E P O 組) 和對(duì)照組( D M E M 組) ，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞和軸突生長(zhǎng)情況，測(cè)量細(xì)胞最長(zhǎng)突起長(zhǎng)度進(jìn)行比較。行G A P 一4 3 的W e s t e r nb l o t 檢測(cè)，圖像分析系統(tǒng)對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行灰度值測(cè)量。結(jié)

2、果行t 檢驗(yàn)。2 、制作大鼠0 N 夾傷模型，分為治療組( r h E P O 組) 和對(duì)照組( 生理鹽水組) 。其中治療組按治療劑量不同分為5 U - r h E P O 組、1 5 U - r h E P O 組和5 0 U - r h E P O 組。不同劑量治療組和對(duì)照組又按夾傷后處死的時(shí)間點(diǎn)不同，分為傷后1 w 、2 w 、4 w 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。模型制作完成當(dāng)時(shí)立即使用微量進(jìn)樣器向術(shù)眼玻璃體腔內(nèi)進(jìn)行注射，不同劑量治療組分別注入5

3、 U 、1 5 U 、5 0 U 的r h E P O ，對(duì)照組則注入5 u1 生理鹽水。3 、分別于傷后1 w 、2 w 、4 w 三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠摘除眼球，制作5 um 視網(wǎng)膜切片，行T h y l ．1 和G A P 一4 3 免疫組化染色。每張切片分別隨機(jī)選取5 個(gè)鏡下視野框( 4 0 0 X ) ，采集鏡下圖像，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)T h y l ．1染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，測(cè)量G A P 一4 3 陽(yáng)性表達(dá)的平均灰

4、度值，結(jié)果行方差分析。4 、利用大鼠0 N 夾傷模型，不同組分別于0 N 損傷前、損傷后即時(shí)、傷后1 w 、傷后2 w 、傷后4 w 進(jìn)行F - V E P 檢查，測(cè)量P 1 波峰潛時(shí)和振幅進(jìn)行比較，結(jié)果行方差分析。結(jié)果l 、培養(yǎng)3 d 的R G C s 倒置顯微鏡下觀察，形成典型的細(xì)胞突起，r h E P O 組的細(xì)胞比對(duì)照組胞體更大，突起更長(zhǎng)( P ( O ．0 5 ) 。2 、培養(yǎng)3 d 的R G C s 行G A P - 4 3

5、W e s t e r nb l o t 檢測(cè)，D M E M 組G A P - 4 3 呈陽(yáng)性表達(dá)，r h E P O 組呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P < 0 ．0 5 ) 。3 、在大鼠0 N 夾傷模型中，o N 損傷后R G C s 數(shù)量隨時(shí)間推移而遞減。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同劑量r h E P O 治療組的R G C s 數(shù)量均多于對(duì)照組( P < O ．0 5 ) ，1 5 U - r h E P O組和5

6、 0 U —r h E P O 組的R G C s 數(shù)量均多于5 U - r h E P O 組( K 0 ．0 5 ) ，而1 5 U - r h E P O 組和5 0U —r h E P O 組之間比較沒(méi)有明顯差異( D O ．0 5 ) 。4 、G A P 一4 3 的免疫組化染色：正常大鼠視網(wǎng)膜上未檢測(cè)到G A P - 4 3 的陽(yáng)性表達(dá)。在大鼠o N 損傷后1 w 時(shí)視網(wǎng)膜上出現(xiàn)G A P - 4 3 較強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)，主要存