重組甘氨酸—胸腺素β4生產(chǎn)工藝研究.pdf

1、心肌梗塞現(xiàn)已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前臨床上的治療藥物和方法很多，但還存在著相當(dāng)大的問題，尤其是尚缺乏提高心肌耐缺血能力和促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)的藥物和方法。已有研究表明，胸腺素β4(簡稱Tβ4)有助于預(yù)防與修復(fù)缺血性心臟病發(fā)作后的心臟損傷，可用于心肌缺血性損傷的治療。要將Tβ4成功開發(fā)成為治療心肌梗塞的藥物，制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立是至關(guān)重要的，本論文針對重組甘氨酸-胸腺素β4(簡稱Gly-Tβ4)的制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥效學(xué)試驗進(jìn)行

2、了研究。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.研究了搖瓶條件下工程菌的生長和誘導(dǎo)條件，得到了優(yōu)化的搖瓶培養(yǎng)條件；研究了工程菌在30L發(fā)酵罐的生長和誘導(dǎo)條件，得到了優(yōu)化的發(fā)酵條件，使目的融合蛋白得到了高效表達(dá)。
　　 2.研究了重組Gly-Tβ4小試純化工藝的建立，包括使用鎳離子金屬螯合層析純化目的融合蛋白，凝膠過濾層析去除咪唑，使用凝血酶對目的融合蛋白進(jìn)行酶切釋放目的蛋白，陰離子交換層析對酶切后的目的蛋白進(jìn)行初步純化，反相層析對

3、目的蛋白進(jìn)行精純化以及去除內(nèi)毒素，陰離子交換層析對反相層析引入的有機(jī)溶劑進(jìn)行去除并濃縮目的蛋白；小試純化工藝方法初步建立后，又進(jìn)行了工藝條件的優(yōu)化，包括鎳離子金屬螯合層析上樣液咪唑加入濃度的研究，凝血酶酶切條件的研究和反相層析洗脫條件的研究。經(jīng)過多批純化證明了小試純化工藝的穩(wěn)定性。
　　 3.研究了重組Gly-Tβ4中試純化工藝的建立，主要通過對小試純化工藝的線性放大，基本按照層析柱直徑增大、層析介質(zhì)高不變、線性流速不變的原則進(jìn)

4、行放大，建立了中試純化工藝，經(jīng)過多批純化證明了中試純化工藝的穩(wěn)定性。
　　 4.研究了重組Gly-Tβ4質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立，重點研究并優(yōu)化了使用反相高效液相色譜分析Gly-Tβ4純度的方法，以及E-玫瑰花結(jié)法測定Gly-Tβ4生物學(xué)活性的方法，建立了完整的Gly-Tβ4原液和成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
　　 5.進(jìn)行了重組Gly-Tβ4的藥效學(xué)研究，使用大鼠心肌梗塞模型進(jìn)行了體內(nèi)生物活性評價研究，結(jié)果表明，Gly-Tβ4對大鼠冠脈結(jié)扎