SAC-TRAIL重組表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、1995年科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體蛋白:TRAIL，它是腫瘤壞死因子超家族成員之一，屬于Ⅱ型跨膜蛋白。人類的TRAIL蛋白是由281aa組成的，由843bp個(gè)編碼序列組成。其胞外區(qū)114～281aa為膜結(jié)合型TRAIL，能在體外誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。由于TRAIL具有廣譜抗癌的功能，且其對(duì)與正常的組織和細(xì)胞幾乎是無(wú)毒的，所以近年來(lái)它作為新型抗腫瘤藥物在臨床得到了廣泛應(yīng)用。但是，對(duì)于某些種類的腫瘤細(xì)胞，TRAIL對(duì)它們

2、誘導(dǎo)凋亡的作用并不明顯。研究顯示NF-κB的活性與TRAIL的作用密切相關(guān)左右，TRAIL可以激活NF-κB信號(hào)通路，而在NF-κB活性高的細(xì)胞系中，TRAIL的誘導(dǎo)凋亡效果明顯下降。
　　 Par基因(prostate apop tosis response)是在1994年由Sells等人在鑒別篩選誘導(dǎo)凋亡的基因時(shí)，采用示差雜交法從凋亡的前列腺癌細(xì)胞中分離出的。par基因包括par-1、-2、-3、-4、-5，而其中par-4

3、基因編碼的Par-4蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系最為密切，在前列腺癌細(xì)胞凋亡時(shí)呈特異性雙峰表達(dá)。Par-4基因位于人類染色體12q21上，其基因產(chǎn)物Par-4蛋白在細(xì)胞中廣泛存在，在胞內(nèi)胞外都具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但不影響正常細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此Par-4就成為理想的抗腫瘤藥物備選分子。Par-4蛋白的C端具有1個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，其N端含有兩個(gè)入核信號(hào)序列，分別為NLS1(20-25)和NLS2(137-153)。其中NLS2序列含有一個(gè)特

4、殊的結(jié)構(gòu)域SAC(the selective for apoptosis induction cancer cells)，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證實(shí)SAC即為Par-4誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，單獨(dú)的SAC結(jié)構(gòu)域即能產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。
　　 研究顯示Par-4的凋亡作用主要是通過(guò)和分子伴侶GRP78結(jié)合，然后抑制NF-κB等通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Par-4的這一特性正好彌補(bǔ)了TRAIL對(duì)某些NF-κB高活性的腫瘤細(xì)胞治療效果不佳的缺陷。

5、r>　　 本研究中，我們嘗試將SAC氨基酸片段與人TRAIL氨基酸片段以柔性氨基酸短臂，頭尾相連融合成為一條多肽鏈SAC-TRAIL，即:SAC-(GGGGS)-TRAIL，以增強(qiáng)抗腫瘤的效果。我們通過(guò)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切、連接技術(shù)，獲得編碼蛋白SAC-TRAIL的基因序列，構(gòu)建了含編碼人SAC-TRAIL基因的重組質(zhì)粒，在宿主菌E.coli BL21中得到了較高水平的表達(dá)，并用麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了初步純化，獲

6、得了融合了麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽的可溶性重組蛋白MBP-SAC-TRAIL。最后，對(duì)MBP-SAC-TRAIL的生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。
　　 第—部分:SAC、SAC-TRAIL編碼序列的構(gòu)建和重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化
　　 以pBV220-TRAIL為模板設(shè)計(jì)一對(duì)引物，我們采用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到TRAIL。通過(guò)公司合成了SAC序列，將其中9個(gè)密碼子更換為大腸桿菌偏愛(ài)型密碼子，將此SAC序列作為模板設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)得到

7、SAC序列。對(duì)SAC和TRAIL的PCR產(chǎn)物分別設(shè)計(jì)另兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增使得兩片段上附帶一小段柔性氨基酸鏈接臂的編碼序列，并且兩片段首尾均帶上了酶切位點(diǎn);以pMAL-C2x為載體，利用酶切連接技術(shù)將酶切后的SAC、TRAIL、pMAL-C2三片段鏈接構(gòu)建重組質(zhì)粒。至此，獲得重組蛋白SAC-TRAIL的基因編碼序列。
　　 以E.coli BL21為表達(dá)宿主菌，用測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pMAL-SAC-TRAIL進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選取陽(yáng)性

8、克隆菌落用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白MBP-SAC-TRAIL，并用MBP親和層析柱純化。經(jīng)SDS-PAGE和免疫印跡驗(yàn)證，在預(yù)期分子量（約70KD）的位置可見(jiàn)明顯蛋白條帶。
　　 第二部分:SAC、SAC-TRAIL生物學(xué)活性研究
　　 用體外藥物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組蛋白的誘導(dǎo)凋亡活性。體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(單細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460)，分為不給藥的對(duì)照加MBP組、MBP-SAC-TRAIL組、MBP-TRAIL組，

9、和加蛋白藥物組進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算抑制率。之后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡技術(shù)對(duì)正常細(xì)胞（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC）和腫瘤細(xì)胞（單細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460、胃癌細(xì)胞7901、胃癌細(xì)胞823、宮頸癌細(xì)胞HeLa），分為不給藥的對(duì)照加MBP組、MBP-SAC-TRAIL組、MBP-TRAIL組，對(duì)5種細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)，從而評(píng)價(jià)重組蛋白的生物學(xué)活性。最后通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞(單細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460)的NF-κB信號(hào)通

10、路激活情況，以驗(yàn)證融合蛋白的雙功能。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 編碼SAC-TRAIL的基因序列得以成功地構(gòu)建并克隆，重組蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中較高效表達(dá)，大部分融合蛋白在細(xì)胞破碎后的上清中以水溶形式存在，其表達(dá)量為15.9％，并能被MBP親和層析柱分離純化，純化后蛋白純度達(dá)到89.6％。
　　 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，MBP-SAC-TRAIL具有很強(qiáng)的的抗腫瘤活性，在50μM的濃度下，作用12個(gè)小時(shí)后4種腫瘤細(xì)胞均發(fā)生