Latcripin-13功能域的克隆表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、背景:肺癌是威脅人類生命健康最大的惡性腫瘤之一。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段缺乏對(duì)其早期檢測(cè)和篩選的有效方法。人們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)肺癌的認(rèn)識(shí)明顯不足，這就迫切需要通過(guò)尋找肺癌的新分子特征和靶點(diǎn)來(lái)改進(jìn)診斷方法并最終達(dá)到靶向治療。
　　許多有效的抗癌藥物已從自然資源中開(kāi)發(fā)。大多數(shù)抗癌藥物都來(lái)自動(dòng)植物的次生代謝產(chǎn)物和其它小分子化合物。然而，近年來(lái)生物大分子的活性引起了研究人員的廣泛關(guān)注。蚯蚓纖溶酶(EFE)在體外和體內(nèi)都對(duì)肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出顯

2、著的抗腫瘤活性。此外，來(lái)自云芝CM-101菌株的一種糖蛋白在體內(nèi)體外都表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。此外，天花粉蛋白——Ⅰ型核糖體失活蛋白，可抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡。香菇是世界第二大食用菌，同時(shí)也是我國(guó)特產(chǎn)之一。香菇隸屬于擔(dān)子菌綱，傘菌目，口蘑科，香菇屬。香菇含有高蛋白、低脂肪、多糖、多種氨基酸和多種維生素，是一種名貴的食藥兩用真菌，在民間素有山珍之王之稱。香菇中含有的香菇多糖可以提高機(jī)體的免疫力。香菇中的水提取物對(duì)體內(nèi)的過(guò)氧化

3、氫有一定的消除作用，在一定程度上也起到延緩衰老的作用。除此之外，香菇對(duì)糖尿病，肺結(jié)核，傳染性肝炎，神經(jīng)炎，便秘，降血壓，降膽固醇，降血脂等起治療作用，又可預(yù)防動(dòng)脈硬化，肝硬化等疾病。
　　我課題組自1990年開(kāi)始，根據(jù)當(dāng)時(shí)國(guó)際針對(duì)香菇藥用價(jià)值研究，采用生物工程發(fā)酵技術(shù)對(duì)6株香菇進(jìn)行菌絲發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)一株經(jīng)發(fā)酵后其發(fā)酵液具有直接抗腫瘤作用，因該菌株于1991年3月開(kāi)始研究，故命名為“C91-3”，“C”表示“China”。
　　基

4、于發(fā)酵液中的一些蛋白組分在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)中表明具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，我課題組對(duì)香菇C91-3菌株轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測(cè)序，獲得了大量的Unigene及其功能注釋信息。其中Unigene為28923條，具有編碼框的Unigene有18120條。根據(jù)基因功能注釋初步結(jié)果，利用在線工具軟件Sanger Pfam進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，從Unigene序列中篩選出凋亡相關(guān)基因Latcripin-13。根據(jù)Latcripin-13轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物，用3'

5、-Full RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends, RACE)、5'-Full RACE方法獲得Latcripin-13基因編碼序列(Coding Sequence，CDS)。目前，我們已經(jīng)完成了Latcripin-13基因編碼序列在GenBank上的序列注冊(cè)(Accession Number:KF682439)。
　　目的:通過(guò)構(gòu)建pET-32a(+)表達(dá)載體將香菇C91-3菌株凋亡相關(guān)蛋

6、白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)香菇C91-3菌株凋亡相關(guān)蛋白Latcripin-13功能域，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能影響，探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為將其開(kāi)發(fā)成為新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。
　　方法:①提取香菇C91-3菌株菌絲體總RNA，參照轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果，通過(guò)3'-FullRACE、5'-Full RACE方法獲得Latc

7、ripin-13基因編碼序列。經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析該蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域。②設(shè)計(jì)特異性引物，利用RCR技術(shù)獲得Latcripin-13功能域序列并將其基因克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)-truncated-latcripin-13，將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE及Western blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)

8、行鑒定。用鎳柱親和層析的方法進(jìn)行分離純化并用BCA法測(cè)定蛋白濃度。用尿素梯度透析的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行復(fù)性，并用圓二色光譜的方法對(duì)復(fù)性后的蛋白進(jìn)行鑒定。③Latcripin-13功能域抗腫瘤活性的鑒定:MTT(Methyl ThiazolyLtetraZolium，MTT)法測(cè)定其對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制率;用FITC標(biāo)記Latcripin-13功能域，并用熒光顯微鏡觀察其在A549細(xì)胞中的定位;用電鏡法檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)

9、的影響;用33258染色法檢測(cè)觀察其對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞的凋亡作用及細(xì)胞周期的影響;JC-1的方法檢測(cè)其對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)的影響;用分光光度法檢測(cè)其對(duì)caspase-3，-8，-9酶活性的影響;用Western blot的方法檢測(cè)Bcl-2，Bax，CCD1，CDK4，NF-κB，GSK3β，p-GSK3β表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:①利用RACE方法獲得了Latcripin-13基因編

10、碼序列。通過(guò)對(duì)Latcripin-13氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)含有染色體濃縮調(diào)節(jié)子(RCC1)和植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD)。②應(yīng)用PCR技術(shù)獲得了latcripin-13功能域基因片段，通過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證插入pET32a(+)中的片段為latcripin-13功能域基因片段。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果證明蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami

11、(DE3)中成功誘導(dǎo)表達(dá)。利用親和層析的方法將其成功純化，圓二色光譜驗(yàn)證結(jié)果顯示其復(fù)性成功。③MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，Latcripin-13功能域作用于A549細(xì)胞呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系(P＜0.05);熒光顯微鏡觀察其確實(shí)進(jìn)入A549細(xì)胞，并分布在細(xì)胞核周圍;電鏡的結(jié)果顯示該蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)出早期凋亡的基本現(xiàn)象;33258染色結(jié)果顯示，該蛋白確實(shí)能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)出核碎裂和染色體皺縮等凋亡現(xiàn)象;流式

12、細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，100μg/ml該蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出時(shí)間依賴關(guān)系，同時(shí)100μg/mlBSA對(duì)照組對(duì)A549無(wú)顯著凋亡的作用;細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，Latcripin-13功能域蛋白對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯作用。JC-1結(jié)果顯示，隨著Latcripin-13功能域蛋白作用濃度的增加，線粒體膜電勢(shì)發(fā)生改變;分光光度法結(jié)果顯示，100μg/ml該蛋白作用于A549細(xì)胞時(shí)，caspase-3，-8，-9被活化;Weste

13、rn blot結(jié)果顯示，隨著Latcripin-13功能域蛋白作用濃度的增加，Bax/Bcl-2比值增加(p＜0.05)，GSK3β/p-GSK3β比值增加(p＜0.05)，NF-κB，CCD1，CDK4表達(dá)量降低。
　　結(jié)論:①根據(jù)香菇C91-3菌株的轉(zhuǎn)錄組序列，成功篩選出凋亡相關(guān)基因Latcripin-13，并成功獲得Latcripin-13基因編碼序列。②成功獲得Latcripin-13功能域片段序列;重組質(zhì)粒pET32a(

14、+)-truncated-latcripin-13成功構(gòu)建;目的蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中成功表達(dá);蛋白Latcripin-13功能域通過(guò)親和層析成功純化;包涵體蛋白Latcripin-13功能域經(jīng)尿素梯度透析成功復(fù)性。③Latcripin-13功能域蛋白進(jìn)入人肺腺癌A549細(xì)胞系并對(duì)其具有誘導(dǎo)凋亡作用，其可能通過(guò)細(xì)胞周期G1期阻滯，NF-κB途徑和線粒體途徑共同作用其凋