馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子在流感研究中的應用及馬IFITM蛋白抗流感病毒的研究.pdf

1、流感病毒反向遺傳系統(tǒng)能夠在體外對流感病毒的基因組進行操作，可以極大的方便對流感病毒的研究。流感病毒最小的復制單位由核糖核蛋白復合物（ribonucleoprotein complex，RNP）組成。在流感病毒反向系統(tǒng)中，PB1、PB2、PA、NP蛋白可以識別由I型RNA聚合酶啟動子驅動生成的負鏈病毒RNA，并以此為模板轉錄生成正鏈互補RNA及mRNA。真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動子具有種屬特異性。一種生物的Ⅰ型RNA聚合酶不能識別另一種

2、生物的Ⅰ型RNA聚合酶啟動子。研究者已經克隆了人源、犬源、雞源、鼠源Ⅰ型RNA聚合酶啟動子，并將其用于流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構建。但是，目前為止，還沒有馬源Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的研究報道。因此，對于流感病毒的很多研究不能在馬源細胞上進行?；诖?，在本研究中，利用真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的位置特點，在GenBank數(shù)據(jù)庫和ensembl數(shù)據(jù)庫中的馬基因組中，檢索并確定了馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子轉錄起始位點。以馬肺細胞基因組DNA為

3、模板，通過PCR，擴增得到了馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子，并構建了不同長度的馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子驅動的馬流感病毒小基因組復制系統(tǒng)。結果表明馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子為500bp時，可以發(fā)揮最大轉錄活性。用建立的馬流感病毒小基因組復制系統(tǒng)，對比了兩株馬流感病毒聚合酶活性的差異，發(fā)現(xiàn)PA蛋白可能是決定兩者聚合酶活性差異的關鍵蛋白。在本研究中，還使用該系統(tǒng)證實了馬MxA蛋白會影響流感病毒聚合酶活性。最后，利用馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子構建了馬流感

4、病毒反向遺傳系統(tǒng)，成功拯救出一株野生型馬流感病毒和一株重組型馬流感病毒。馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的成功克隆及應用，豐富了我們對真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的認識。利用馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子構建的流感病毒小基因組復制系統(tǒng)是在馬源細胞上研究流感病毒聚合酶活性的有效工具，而在此基礎上構建的馬流感病毒反向系統(tǒng)將方便研究者在馬源細胞上對流感病毒進行操作。
　　最近的研究表明，人源、豬源、雞源、鴨源、鼠源IFITM蛋白都具有抗流感病毒活性

5、。馬屬動物是流感病毒的重要宿主，但對于馬源IFITM蛋白是否也具有抗流感病毒作用卻未見報道。在本研究中，通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索馬IFITM基因，設計了靶向馬IFITM基因的特異性引物。通過RT-PCR，擴增得到了6個馬IFITM基因。首先，我們描述了馬IFITM mRNA的表達特性：通過熒光定量PCR，檢測了馬源細胞及組織中的IFITM mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)不同IFITM的mRNA表達水平有所差異；經干擾素處理和流感病毒感染

6、后，馬源細胞中IFITM mRNA表達水平會上調；但是感染馬皰疹病毒后，馬源細胞中IFITM mRNA表達水平未發(fā)生變化。然后，為了明確馬IFITM蛋白的細胞定位，構建了表達馬IFITM蛋白的真核表達載體，間接免疫熒光和Western blot實驗都表明馬IFITM蛋白成功表達；激光共聚焦實驗的結果表明不同馬IFITM蛋白的細胞定位并不相同；其中，馬IFITM3蛋白與LAMP1蛋白呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象，而其它馬IFITM蛋白不與LAMP1蛋白

7、共定位。最后，通過瞬時轉染外源表達質粒和構建穩(wěn)定表達IFITM蛋白細胞系這兩種策略，利于基于I型RNA聚合酶啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng)，檢測了馬IFITM蛋白的抗流感活性：通過慢病毒感染實驗，建立了穩(wěn)定表達馬IFITM蛋白的MDCK細胞系；間接免疫熒光試驗的結果表明，在MDCK細胞系中，馬IFITM蛋白都成功表達；利用基于馬或犬I型RNA聚合酶啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng)，證實在細胞中過表達或者穩(wěn)定表達馬IFITM蛋白都會限制流感病毒復制

8、。對馬源 IFITM蛋白的抗流感病毒活性研究，將加深我們對IFITM蛋白抗流感病毒作用的理解，也為相應的抗流感藥物的研發(fā)提供了理論基礎。
　　2012年以來，在馬群中發(fā)現(xiàn)了三種新的黃病毒科病毒：馬丙型肝炎病毒（equine hepatitis C virus，EHCV）、EPgV（equine pegivirus）、泰勒病相關病毒（Theiler’s disease-associated virus，TDAV）。目前，在世界范圍內

9、，關于這三種新發(fā)馬病病毒的報道較少。在國內的馬群中，也沒有這三種病毒的流行病學報道。在2014年和2015年，我們從國內的馬群中采集了177份血清樣品。通過PCR，在血清樣品中，檢測到了6份EHCV陽性樣品和2份EPgV陽性樣品。在檢測過程中，沒有發(fā)現(xiàn)這兩種病毒共感染的證據(jù)。在所有樣品中沒有檢測到TDAV核酸。對EHCV的NS5B基因、NS3基因、5’非轉錄區(qū)序列以及EPgV的NS3基因序列進行進化樹分析。結果表明，EHCV和EPgV已