馬流感病毒抗原捕捉ELISA檢測方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、馬流感是由馬流感病毒(Equine influenza virus,EIV)引起馬屬動物的一種急性呼吸性傳染病,具有國際傳播性、高度傳染性、發(fā)病頻率高、發(fā)病率不穩(wěn)定和死亡率低等特點(diǎn)。隨著北京奧運(yùn)會和廣州亞運(yùn)會馬術(shù)比賽的成功舉辦,賽馬運(yùn)動在我國逐漸發(fā)展為一種異軍突起的新興產(chǎn)業(yè)。同時我國又有著豐富的馬驢產(chǎn)業(yè),因此馬流感防控工作任重而道遠(yuǎn),建立一種快速、可靠、適于基層使用的EIV診斷方法對于馬流感防治十分必要。
　　 本研究以實驗室保

2、存的EIV A／馬／新疆／07(H3N8)(簡稱XJ株)為基礎(chǔ)毒株,通過RT-PCR方法,擴(kuò)增出NP基因并克隆至pMD-18T載體。測序鑒定正確后,通過雙酶切將NP基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET-30a,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-NP并轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)。通過對表達(dá)條件的優(yōu)化,最終獲得分子質(zhì)量約64ku、可溶性形式的重組蛋白NP,并采用鎳柱對該蛋白進(jìn)行純化。Western blot檢測結(jié)果表明,重組蛋白NP及純化NP均能與馬流

3、感陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng),具有良好的抗原性。
　　 將純化NP作為免疫原,腹腔接種4周齡BALB／c小鼠。按照常規(guī)雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)將免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2／0融合。用蔗糖密度梯度純化的XJ株為篩選抗原,建立間接ELISA方法,篩選出針對NP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。最終獲得三株能夠穩(wěn)定分泌NP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(2G11、3E10和4A1)。Western blot、間接免疫熒光和間接ELISA結(jié)果表明三株單克隆抗體均能特

4、異性識別重組蛋白NP,與天然EIV結(jié)合,而與His標(biāo)簽蛋白和馬日本腦炎病毒、馬皰疹病毒1／4型及馬動脈炎病毒均不發(fā)生反應(yīng)。
　　 用蔗糖密度梯度純化的XJ株和純化NP為免疫原接種家兔,分別制備針對EIV XJ株的多克隆抗體(簡稱抗EIV多抗)和抗NP多克隆抗體(簡稱抗NP多抗)。選取單克隆抗體2G11分別與抗EIV多抗和抗NP多抗建立四種抗原捕捉ELISA方法,即以抗EIV多抗為捕獲抗體,2G11為檢測抗體的抗原捕捉ELISA1

5、；以2G11為捕獲抗體,抗EIV多抗為檢測抗體的抗原捕捉ELISA2以2G11為捕獲抗體,抗NP多抗為檢測抗體的抗原捕捉ELISA3和以抗NP多抗為捕獲抗體,2G11為檢測抗體的抗原捕捉ELISA4。將優(yōu)化的四種方法分別與馬皰疹病毒1／4型、馬乙型腦炎病毒和馬動脈炎病毒進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗,均不發(fā)生反應(yīng),具有較高的特異性。四種抗原捕捉ELISA方法均與H7N7亞型EIV有交叉反應(yīng),且敏感性明顯高于血凝試驗結(jié)果。尤其是第4種方法,對禽源性A／

6、馬／吉林／89(H3N8)(簡稱JL株)、歐洲系A(chǔ)／馬／青海／94(H3N8)(簡稱QH株)和A／馬／邁阿密／63(H3N8)(簡稱Miami株)都具有很高的敏感性。
　　 采用噴霧法對無EIV抗體的幼駒進(jìn)行攻毒試驗。攻毒后連續(xù)10d采集鼻拭子,同時進(jìn)行病毒分離、多重RT-PCR和上述四種抗原捕捉ELISA。試驗結(jié)果表明,第4種抗原捕捉ELISA與病毒分離和多重RT-PCR符合性最好,可檢測到攻毒后第3-7d的病毒粒子。初步證明