馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的建立.pdf

1、馬流感病毒（Equine Influenza Virus，EIV）是感染馬屬動物并引發(fā)馬流感的一種重要的傳染病病原。其基因組由8條分節(jié)段的負鏈RNA構(gòu)成，編碼至少10種蛋白。1989年在中國黑龍江省和吉林省馬流感疫情中分離到的 A/equine/Jilin/1/1989(H3N8)（簡稱 JL89）顯示出與其他 EIV有顯著的差別。其基因在系統(tǒng)發(fā)育學上，介于EIV和禽流感病毒之間，且顯示與禽流感病毒有更近的親緣關(guān)系，這提示此病毒可能來源

2、于禽類，打破種間屏障傳播給馬。此外，此病毒在馬群中引起較高的發(fā)病率和死亡率。因而研究其分子進化與致病機理對理解和防控馬流感具有重要意義。反向遺傳學作為研究病毒的有力工具，在揭示流感病毒的跨種傳播機制，致病機理，毒力決定因素等方面發(fā)揮著重要作用。因此，建立針對JL89的反向遺傳操作系統(tǒng)將為解釋JL89的上述科學問題提供平臺。
　　首先，本研究構(gòu)建了含有EF1-α和polI啟動子的質(zhì)粒pEZ。并利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒pEZ-vE

3、GFP和pEZ分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，一方面， pEZ-vEGFP組可以觀察到綠色熒光，而pEZ組觀察不到；另一方面，pEZ-vEGFP組中可以擴增出vEGFP編碼區(qū)和其非編碼區(qū)，而pEZ組沒有擴增出來；從而在+RNA和-RNA兩個方面驗證pEZ的具有相向轉(zhuǎn)錄的功能。其次，為了獲得JL89基因組全序列，分別對8個節(jié)段的編碼區(qū)和非編碼區(qū)克隆并測序。一方面，利用RT-PCR技術(shù)，以提取的病毒RNA為模板，擴增8個節(jié)段，并測序；另一方面，

4、使用RNA連接和RT-PCR技術(shù)，擴增8個非編碼區(qū)，并測序。這樣便獲取了JL89的全基因組序列。然后，利用分子克隆技術(shù)將 JL89的8個全長的 cDNA分別克隆到 pEZ中形成重組質(zhì)粒，并通過 western blot分析pEZ-HA轉(zhuǎn)染HEK293T細胞中HA蛋白表達情況，結(jié)果顯示HA表達良好。進一步研究，將8個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞拯救病毒。通過測定上清中的病毒粒子的TCID50，顯示其滴度達5.34±0.22個log10

5、TCID50/mL；經(jīng)雞胚擴大培養(yǎng)后測定其HA效價達到8 log2/50μL；在MDCK細胞上的生長特性與親本相似；序列亦與親本100％一致。這些證據(jù)充分顯示已經(jīng)建立起JL89的反向遺傳平臺。而為了進一步提高了本系統(tǒng)的嚴謹性，通過定點突變技術(shù)在HA節(jié)段上作兩個點突變使其擁有HindIIII和NdeI酶切位點。經(jīng)RLFP分析顯示拯救出的分子標記病毒的HA節(jié)段可以被HindIIII和NdeI分別或同時切成2或3條帶，而親本的不能。這樣便區(qū)分