NP突變體抑制流感病毒復(fù)制的機(jī)制及形成流感病毒病毒樣顆粒的關(guān)鍵蛋白.pdf

1、流感病毒危害嚴(yán)重，不僅感染人和多種動(dòng)物，而且可以引起人和動(dòng)物發(fā)病死亡，因而容易引發(fā)巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)問(wèn)題。深入了解病毒的生物學(xué)特性及其蛋白間的相互作用機(jī)理，研制廣譜高效的抗流感藥物及研發(fā)新型流感疫苗一直是流感病毒研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題。
　　在流感病毒的蛋白中，核衣殼蛋白是流感病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮著重要的作用。由于NP蛋白非常保守，因此非常適合作為廣譜抗流感藥物設(shè)計(jì)的靶標(biāo)蛋白。
　　本文從可抑制野生 NP蛋白功能

2、的NP蛋白突變體（NPA387R）入手，利用表達(dá)熒光素酶流感病毒微復(fù)制系統(tǒng)，通過(guò)對(duì) NPA387R進(jìn)行定點(diǎn)突變以及部分刪除突變，發(fā)現(xiàn)這些突變體在微復(fù)制系統(tǒng)中均喪失了轉(zhuǎn)錄活性，刪除 NPA387R上第一個(gè)核定位信號(hào)不影響突變體抑制野生NP的功能，但是同時(shí)刪除NPA387R上兩個(gè)核定位信號(hào)后突變體喪失了抑制野生 NP的功能。為了確定核定為信號(hào)是否決定突變體對(duì)野生 NP的抑制功能，我們?cè)趧h除第一個(gè)核定位信號(hào)基礎(chǔ)上，將第二個(gè)核定位信號(hào)進(jìn)行了突變

3、，發(fā)現(xiàn)該突變體仍然可以抑制野生NP的功能。
　　進(jìn)一步我們建立了穩(wěn)定表達(dá) NP突變體（NPA387R）的細(xì)胞系和穩(wěn)定表達(dá)刪除第一個(gè)核定位信號(hào)和突變第二個(gè)核定位信號(hào)突變體的細(xì)胞系，通過(guò)免疫共聚焦實(shí)驗(yàn)證明 NP突變體（NPA387R）由于保留了核定位信號(hào)，主要定位于細(xì)胞核；而突變核定位信號(hào)的NP突變體主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。這兩個(gè)細(xì)胞系均不再支持PR8病毒的生長(zhǎng)，表明突變體NP同樣可以抑制流感病毒的復(fù)制。
　　突變體 NP是如何導(dǎo)致

4、野生 NP不能行使正常功能呢？為回答這一問(wèn)題，我們采用免疫共沉淀（Co-IP）、蔗糖梯度密度離心和Western blot等方法分析NP-NP相互作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生 NP之間可以相互作用形成的復(fù)合體主要分布在蔗糖梯度的下層，而NP突變體與BSA一樣主要以低聚體形式存在，分布在蔗糖梯度的上層。當(dāng)突變體與野生 NP作用后在蔗糖中的分布發(fā)生了改變，野生 NP的分布向蔗糖梯度的上層移動(dòng)，而突變體NP向蔗糖梯度的下層移動(dòng)，表明突變體與野生N

5、P之間相互作用過(guò)程中，突變體 NP參與到野生 NP的多聚體中。結(jié)合突變體的細(xì)胞定位，表明 NP與 NP的作用是在未進(jìn)入細(xì)胞核之前就已經(jīng)發(fā)生，通過(guò)相互作用，突變體影響野生NP形成正常的RNPs，從而喪失聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性。這一重要的發(fā)現(xiàn)為研制抗流感藥物提出了新的思路，即抑制 NP功能的抗流感藥物在細(xì)胞質(zhì)中即可發(fā)揮作用。
　　此外，采用同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因的真核表達(dá)系統(tǒng)研究影響流感病毒病毒樣顆粒包裝及釋放的主要結(jié)構(gòu)蛋白。實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)

6、HA、NA和M1，HA和NA以及只表達(dá) HA的真核表達(dá)質(zhì)粒，將這些表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，表達(dá)三個(gè)基因以及表達(dá)兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清均有血凝活性，最高效價(jià)達(dá)到24，而只表達(dá) HA基因的細(xì)胞上清沒(méi)有血凝活性。將這些上清超速離心，在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)表達(dá)三個(gè)基因和表達(dá)兩個(gè)基因的樣品中均有病毒樣顆粒存在，而單獨(dú)表達(dá)HA的樣品沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒樣顆粒。說(shuō)明表達(dá)HA、NA蛋白就可以包裝并釋放病毒樣顆粒，而M1蛋白對(duì)流感病毒病毒樣顆粒的包裝和釋