冰香散抗流感病毒作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)檢測(cè)鼠流感Th1/Th2免疫因子及氣管粘膜TLR2/4mRNA、MYD88mRNA的表達(dá)變化，探討冰香散揮發(fā)油制劑對(duì)流感病毒的防治作用及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，并根據(jù)前期對(duì)冰香散大量的研究，通過(guò)雞胚實(shí)驗(yàn)初步探討具體藥效學(xué)基礎(chǔ)物質(zhì)。
　　方法:
　　一、揮發(fā)油的提取用水蒸氣蒸餾法提取實(shí)驗(yàn)所用的揮發(fā)油制劑，提取工藝為將藥材粉碎成中粉，加10倍量的水浸泡1.5小時(shí)，通過(guò)水煮蒸餾的方法提取6小時(shí)。
　　二、鼠流感

2、病毒動(dòng)物模型的建立、取材選用BALB/c小鼠，隨機(jī)分為正常組、病毒對(duì)照組、利巴韋林組、冰香散揮發(fā)油制劑滴鼻組、冰香散揮發(fā)油制劑霧化組，采用不同的給藥方式預(yù)防性給藥7d，第8天以15LD50攻毒，再持續(xù)給藥5天后取材。取肺行肺組織病理學(xué)檢查觀察病變;取脾臟、氣管置于生理鹽水中洗去血液，離體后30min內(nèi)速冷凍保存于液氮中待用。
　　三、脾淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子RT-PCR檢測(cè):異硫氰酸胍一步法提取小鼠脾臟組織總RNA，分光光度計(jì)法定

3、量。根據(jù)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和β-actin的eDNA序列，分別設(shè)計(jì)上游和下游引物。取2ug總RNA加入AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR，擴(kuò)增參數(shù)為94℃30s，60℃45s，72℃60s，循環(huán)30次。以2％瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　四、氣管粘膜TLR2/TLR4、MYD88 Real-time PCR檢測(cè):取100mg氣管粘膜，trizol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后，核酸蛋白紫

4、外分析儀檢測(cè)RNA的濃度，要求A260/A280在118-210，并調(diào)整RNA濃度至1mg/L。取1μg RNA，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在Step One QPCR儀上用SYBR GreenⅠ熒光染料技術(shù)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。UDG2min，95℃預(yù)變性2min，設(shè)計(jì)循環(huán)程序:95℃變性15s，62.5℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品分析三次，反應(yīng)結(jié)束后做熔解曲線(xiàn)以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。實(shí)時(shí)熒光

5、定量PCR結(jié)果分析采用2-△△Ct分析法。
　　五、藥物最大無(wú)毒劑量(TD0)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)設(shè)有空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、利巴韋林注射液組、廣藿香揮發(fā)油組、艾葉揮發(fā)油組，冰片組。利巴韋林注射液的給藥劑量分別為10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚、1.25mg/胚、0.625mg/胚;廣藿香揮發(fā)油組藥劑量分別為20mg/胚、15mg/胚、10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚;艾葉揮發(fā)油組的給藥劑量為20mg/胚、15mg/胚、10

6、mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚;冰片的給藥劑量分別為0.3mg/胚、0.25mg/胚、0.2mg/胚、0.15mg/胚、0.12mg/胚;各藥物每個(gè)劑量組接種5個(gè)雞胚，按尿囊腔接種方法將藥物接種到尿囊腔中，0.1ml/胚?？瞻讓?duì)照組給予同體積的生理鹽水，溶劑對(duì)照組給予同體積0.5％聚山梨脂-80水溶液。注射藥物、封完口后把雞胚放入37℃、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱孵育96h，每日翻蛋2次，觀察雞胚的發(fā)育情況，24h內(nèi)死亡的棄去，以雞胚全部

7、存活的最大給藥劑量為藥物的最大無(wú)毒劑量。
　　六、流感病毒對(duì)雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定取毒種，用流水沖浸融化，用生理鹽水將病毒液稀釋成10-1～10-8倍，按尿囊腔接種方法接種病毒，每個(gè)稀釋度接種6個(gè)雞胚，0.1ml/胚，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，一定的濕度培養(yǎng)，逐日觀察雞胚的存活情況，24h內(nèi)死亡的棄去，剩下的胚孵育48h后置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，收獲每個(gè)雞胚的尿囊液，進(jìn)行HA試驗(yàn)，形成“+”凝集為感染陽(yáng)性，采用Reed-Mue

8、nch法計(jì)算流感病毒對(duì)雞胚的EID50。
　　七、各藥物對(duì)流感病毒的防治作用預(yù)防作用即先加藥，1h后再感染流感病毒，治療作用即先感染流感，1h后再加藥。實(shí)驗(yàn)設(shè)有空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組、利巴韋林組、三種實(shí)驗(yàn)藥物組。利巴韋林的給藥劑量為5mg/胚;廣藿香揮發(fā)油的給藥劑量分別為10mg/胚、5mg/胚、2.5mg/胚;艾葉揮發(fā)油的給藥劑量分別為5mg/胚、2.5mg/胚、1.25mg/胚;冰片的給藥劑量分別為0.15mg/胚、0.12m

9、g/胚、0.06mg/胚，給藥體積為0.1ml/胚，每個(gè)給藥劑量5個(gè)雞胚，病毒攻擊量為50 EID50。預(yù)防性給藥組中空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組給予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液其余各藥物組給予0.1ml藥物，37℃孵育1h后除了空白對(duì)照組給予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液外其余各組分別接種0.1ml流感病毒;治療性給藥組中除空白對(duì)照組給予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液外其余各組分別接種0.1ml流感病毒，37

10、℃孵育1h后各給藥組接種0.1ml的藥物，空白對(duì)照、病毒對(duì)照組給予0.1ml的0.5％聚山梨脂-80水溶液。37℃、一定濕度的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，每天照檢1次，每日轉(zhuǎn)動(dòng)1～2次，24h內(nèi)死亡的棄去，孵育48h后置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜，收獲每個(gè)雞胚的尿囊液，進(jìn)行HA試驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　小鼠經(jīng)H1N1感染后與正常組相比TLR2/4mRNA、MYD88mRNA、IFN-γmRNA表達(dá)水平上升(P＜0.01)，IL-4、IL-5mRNA表達(dá)

11、水平下降(P＜0.01)。與病毒對(duì)照組相比利巴韋林組可顯著增加IL-4mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，降低IFN-γmRNA表達(dá)(P＜0.05);冰香散揮發(fā)油制劑滴鼻、霧化組能顯著增加IL-4 mRNA、IL-5mRNA的表達(dá)水平(P＜0.01或P＜0.05)，但在降低IFN-γmRNA的表達(dá)上冰香散揮發(fā)油制劑滴鼻組的效果比較顯著(P＜0.05)。各給藥組都有降低TLR2/4、MYD88基因的表達(dá)的趨勢(shì)，但只有冰香散揮發(fā)油制劑滴鼻組的作