異型流感病毒感染交叉保護(hù)作用研究.pdf

1、流行性感冒(Influenza，簡稱流感)是由流行性感冒病毒(Influenza virus，簡稱流感病毒)引起的急性呼吸道病，潛伏期短、發(fā)病率高、傳染性強、傳播快，對人類健康威脅極大。流感病毒核酸為分節(jié)段單鏈負(fù)股RNA，通常分8個片段。根據(jù)NP和M抗原的不同，流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，又可根據(jù)HA和NA抗原的差別分為不同亞型。甲型流感病毒(InfluenzaAvirus，IAV)有17個HA亞型和10個NA亞型。流感

2、病毒基因組中突變率最高的是HA基因，其次是NA基因。其變異機理涉及分子水平的抗原漂移(antigenic drift)和抗原轉(zhuǎn)換(antigenic shift)。
　　由于流感病毒易變異，且流感至今尚無特效治療方法，因此流感的預(yù)防顯得尤為重要。接種疫苗是預(yù)防流感最有效的手段?，F(xiàn)有疫苗都是株特異性的，通過體液免疫產(chǎn)生的中和抗體對抗病毒感染，疫苗所含的抗原必須和流行株抗原有較高的相似性才能起到保護(hù)作用。異型流感病毒感染時，疫苗的保護(hù)

3、作用受到限制。因此，“普遍的”、“通用型”疫苗成為科學(xué)家關(guān)注的焦點。近幾十年來，眾多學(xué)者利用各種甲型流感病毒共有抗原成分，如NP或M，制備疫苗免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)可以在異型流感病毒間發(fā)生部分交叉免疫。另外，流感病毒疫苗和佐劑連接疫苗亦存在部分異型株間交叉免疫保護(hù)作用。研究表明，流感病毒特異性抗體，往往由流感病毒表面蛋白HA抗原刺激產(chǎn)生，特異性強，不能中和異型流感病毒;而上述流感病毒共有抗原產(chǎn)生的抗體，抗體滴度低或為非中和抗體，達(dá)不到阻止異型流

4、感病毒感染的目的。特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)在抗異型流感病毒感染中的作用，尚無統(tǒng)一結(jié)論，仍需進(jìn)一步研究。
　　為了解H5亞型和H1亞型間的交叉保護(hù)作用，我們選擇了H5亞型流感疫苗免疫小鼠，H1亞型流感病毒感染小鼠，發(fā)現(xiàn)H5亞型和H1亞型間存在交叉保護(hù)作用，且異型流感病毒感染小鼠肺中IFN-γ水平明顯增高。基于這一結(jié)果，在后續(xù)的實驗中，以IFN-γ為中心，研究在異型流感病毒感染過程中與其相關(guān)的免疫分子及細(xì)胞的變化情況。IFN-γ既可以阻

5、止病毒在體內(nèi)的復(fù)制、擴(kuò)散，又能對多種免疫細(xì)胞發(fā)揮強大的調(diào)節(jié)作用，在抗流感病毒感染的過程中同樣發(fā)揮重要作用。那么與IFN-γ相關(guān)的其他細(xì)胞因子表達(dá)水平如何？它們在異型流感病毒感染中發(fā)揮作用如何？肺泡巨噬細(xì)胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAM)作為重要的抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)，其表面分子的表達(dá)可能會影響流感病毒異型免疫（Heterosubtypic immu

6、nity，HSI）的能力。這些表面分子在流感病毒的HSI中表達(dá)水平升高還是降低？是增強免疫還是抑制免疫？這些問題有待于進(jìn)一步深入研究。
　　IFN-γ可以促使CD8+T細(xì)胞成熟為效應(yīng)CTL細(xì)胞;活化巨噬細(xì)胞，提高其吞噬能力;激活NK細(xì)胞，增強其清除感染細(xì)胞的能力。T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞。在異型流感病毒感染的過程中，T細(xì)胞的增殖活性如何？執(zhí)行細(xì)胞免疫功能的、有活性的T細(xì)胞水平如何？巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞是執(zhí)行免疫應(yīng)答的一種重要細(xì)

7、胞，具有抗原加工、提呈和免疫調(diào)節(jié)等作用。巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞雖然是固有免疫中重要的免疫細(xì)胞，但它們也是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁。在流感病毒的HSI中，巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞發(fā)揮怎樣的作用？其殺傷能力如何？
　　為回答上述問題，我們擬對小鼠進(jìn)行H5亞型流感病毒免疫、H1流感病毒感染，特別采用免疫佐劑IL-2加強免疫，通過對比分析各組小鼠主要免疫分子水平及免疫細(xì)胞功能變化的特點，以期確定異型流感病毒交叉保護(hù)作用的主要效應(yīng)機制，及與IF

8、N-γ相關(guān)的免疫分子、免疫細(xì)胞的水平、活性，為流感的預(yù)防和有效控制提供新的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　一、實驗材料
　　1、流感病毒A/H1N1;rL H5流感重組活疫苗、A/H5N1流感滅活疫苗;2、6-8周齡雌性C57BL/6小鼠;
　　3、細(xì)胞因子檢測試劑盒;
　　4、RNA提取相關(guān)試劑，RT試劑盒，Real-time PCR相關(guān)試劑;
　　5、MTT檢測試劑盒;
　　6、流式細(xì)胞術(shù)

9、檢測相關(guān)抗體及試劑;
　　7、NO檢測相關(guān)試劑等。
　　二、實驗方法
　　1、C57BL/6小鼠(6-8周，雌性)隨機分組:異型免疫組，異型免疫加強組，同型組，PBS對照組，IL-2對照組。分別用流感疫苗、A/H1N1病毒和PBS免疫小鼠兩次，用A/H1N1流感病毒感染。在感染前(0d)和感染后4d、7d處死小鼠，收集肺泡灌洗液，肺、脾組織，血液等樣品。
　　2、記錄小鼠肺重、體重和死亡情況，計算肺指數(shù)和生存率。

10、
　　3、ELISA方法測定肺中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平，流式細(xì)胞術(shù)測定CD4+T、CD8+T細(xì)胞水平。
　　4、Real-time PCR方法測定肺內(nèi)病毒量。
　　5、血清中H1N1抗體水平測定。
　　6、PAM表面MHCⅠ、MHCⅡ和TLR7測定。
　　7、細(xì)胞因子IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α的測定。
　　8、T細(xì)胞增殖活性測定及IFN-γ+CD4+T和IF

11、N-γ+ CD8+T細(xì)胞水平測定。
　　9、巨噬細(xì)胞釋放NO能力的測定。
　　10、CD49b+ NKG2D+ NK細(xì)胞水平測定。
　　11、使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±s）表示，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計學(xué)差異;當(dāng)有統(tǒng)計學(xué)意義時，用SNK法進(jìn)行組間比較，p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、流感病毒異型免疫組和異型免疫加強組與PBS組相比

12、，小鼠生存率升高、肺指數(shù)、肺病毒載量降低;異型免疫組和異型免疫加強組肺內(nèi)的IL-10和IFN-γ的含量、脾中CD4+T和CD8+T細(xì)胞水平顯著高于同型免疫組和感染前。除同型對照組外，其他各組未有H1N1抗體檢出。
　　2、流感病毒異型免疫組和異型免疫加強組小鼠PAM表面的MHCⅠ的表達(dá)水平顯著高于感染前和同型免疫組，且異型免疫加強組高于異型免疫組。其他表面分子未見顯著變化。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠肺中細(xì)胞因子IL-6、IL-

13、18和TNF-α的水平分別顯著高于PBS組和單純使用IL-2組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠肺中細(xì)胞因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平顯著高于同型免疫組。IL-12的含量未見顯著變化。
　　3、流感病毒異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中T細(xì)胞的增殖活性顯著高于PBS組和感染前。感染后7d異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+ CD8+T細(xì)胞的含量顯著高于感染前和同型免疫組。異型免疫加強

14、組小鼠脾臟中IFN-γ+ CD4+T和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的含量顯著高于單純使用IL-2組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞釋放的NO水平顯著高于同型免疫組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞釋放的NO水平分別顯著高于PBS組和單純使用IL-2組。異型免疫組和異型免疫加強組小鼠脾中CD49b+ NKG2D+ NK細(xì)胞水平顯著高于同型免疫組和PBS組。
　　結(jié)論：
　　1、流感病毒H5亞型與H1亞型

15、間存在交叉免疫保護(hù)作用。
　　2、在流感病毒的HSI中，抗體的保護(hù)作用不大，細(xì)胞免疫保護(hù)作用明顯。T細(xì)胞增殖能力顯著增強，IFN-γ+CD4+T細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞含量顯著增加。異型流感病毒感染后肺中IFN-γ水平升高，巨噬細(xì)胞分泌IFN-γ相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-18和TNF-α水平升高，共同發(fā)揮抗病毒感染的功能。巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞活性增強。
　　3、PAM表面分子MHC-Ⅰ表達(dá)顯著升高，在流感病毒HSI中