豚鼠抗A型流感病毒感染的天然免疫應(yīng)答機(jī)制研究.pdf

1、A型流感病毒屬于正粘病毒科RNA病毒，可以引起人類發(fā)生急性呼吸道疾病。自上個(gè)世紀(jì)初期開(kāi)始，世界上已發(fā)生了多次流感大流行。大流行流感和季節(jié)性流感對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重的影響。更讓人們擔(dān)心的是人高致病性禽流感感染者的病死率高達(dá)60％以上，此類流感一旦在人間大流行將引起災(zāi)難性的后果。研究者發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感引起感染者和動(dòng)物模型死亡的主要原因是細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)引起的免疫損傷(“細(xì)胞因子風(fēng)暴”)，但其發(fā)生和作用機(jī)制還不明確，本研究更換了研

2、究視角，以可以被高致病性流感病毒感染但不表現(xiàn)出臨床癥狀的豚鼠為模型，探討豚鼠感染A型流感病毒以后，模式識(shí)別受體、效應(yīng)分子、細(xì)胞因子和趨化因子的應(yīng)答特點(diǎn)，從而探索先天免疫在流感病毒致病機(jī)制中的作用。
　　 首先，建立了與天然免疫相關(guān)的因子的定量PCR檢測(cè)方法，包括豚鼠的IFN-β、IL-10、IL-18、IL-8、IP-10、TLR7、TLR8、RIG-1、MDA5、NLR、STAT1、MAVS、MX1、PKR、Caspase-1

3、、TNF、IFN-γ、IL-1β、CCL2、CCL5、TLR3。以該方法，用于檢測(cè)不同致病力表型的H1N1和H5N1流感病毒感染豚鼠后肺臟中上述相關(guān)因子的mRNA表達(dá)量，并對(duì)其特異性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示該方法特異性好，基因擴(kuò)增效率基本一致，可以通過(guò)△△Ct法對(duì)mRNA的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 進(jìn)而用不同致病力的四株A型流感病毒(兩株H1N1亞型，兩株H5N1亞型)感染豚鼠，通過(guò)對(duì)豚鼠肺臟和鼻洗液進(jìn)行病毒復(fù)制滴度檢測(cè)，結(jié)果

4、顯示感染H1-XD、H1-UI-182、H5-132、H5-LW亞型流感病毒后的豚鼠鼻洗液病毒EID50最高分別可達(dá)104.5/ml、105.25/ml、105.75/ml、101.98/ml，肺臟中病毒EID50分別為105.5/ml、102.5/m1、105.25/ml、102.25/ml，但是所有攻毒第5天之后的樣品均檢測(cè)不到病毒滴度。結(jié)果表明A型H1N1和H5N1亞型流感病毒可以在豚鼠肺臟內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，但是并不引起機(jī)體產(chǎn)生臨床癥狀

5、，3-5天之后病毒就被機(jī)體清除掉。
　　 為闡明豚鼠的先天免疫應(yīng)答在病毒感染與清除中的特征，我們對(duì)豚鼠感染病毒前后肺組織中與先天免疫相關(guān)的的模式受體與細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果，對(duì)小鼠表現(xiàn)出致病性差異的H1N1亞型流感病毒感染豚鼠后，豚鼠的模式識(shí)別受體、效應(yīng)分子、細(xì)胞因子和趨化因子均未發(fā)生明顯的應(yīng)答；但與甲型H1N1病毒感染豚鼠表現(xiàn)不同的是，豚鼠感染在小鼠上表現(xiàn)出不同致病力表型的H5N1高致病性流感病毒后，豚鼠的模式

6、識(shí)別受體RIG-1和MDA5升高明顯，下游效應(yīng)分子MX1和PKR升高顯著，說(shuō)明豚鼠的產(chǎn)生了針對(duì)H5N1病毒的先天免疫應(yīng)答，但另人感興趣的是，豚鼠體內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子變化不明顯，尤其是IL-1、IL-8和TNF-α幾種細(xì)胞因子“風(fēng)暴”標(biāo)志性細(xì)胞因子均未明顯增高，說(shuō)明豚鼠可能有別于其他哺乳動(dòng)物，具有抑制細(xì)胞因子“風(fēng)暴”發(fā)生的能力，從而保護(hù)機(jī)體免受泛嗜性炎癥損傷。
　　 本研究結(jié)果提示我們可以通過(guò)進(jìn)一步研究闡明豚鼠先天免疫應(yīng)答在抗流