豬流感病毒感染A549細(xì)胞的亞細(xì)胞蛋白組分析.pdf

1、豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)隸屬于分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒正黏病毒科，除能感染豬體外，還具有感染人類的跨種間傳播能力。病毒基因組為分節(jié)段的8條單股負(fù)鏈RNA，編碼PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M1、M2、NS1及NEP(NS2)等10種以上蛋白。目前關(guān)于流感病毒跨種間感染的機(jī)制研究較少。本研究以SIV感染人肺上皮細(xì)胞A549為模型，應(yīng)用亞細(xì)胞蛋白組學(xué)方法對(duì)SIV感染細(xì)胞的蛋白表達(dá)變化進(jìn)行了

2、探索。
　　 4、SIV編碼蛋白的亞細(xì)胞定位
　　 采用純化病毒、Ni2+親和純化的原核表達(dá)蛋白NP、NS1、M1為免疫原，免疫BALB/c小鼠、新西蘭大白兔，分別獲得了NP蛋白單克隆抗體分泌細(xì)胞3株、M1蛋白單克隆抗體分泌細(xì)胞6株、NS1蛋白單克隆抗體分泌細(xì)胞6株及兔抗NP、NS1、M1蛋白多克隆抗體。采用熒光雙標(biāo)法，以制備的抗體為工具，分析了H3N2、H1N1 SIV及A/PR8/34/H1N1(PR8)感染A549

3、細(xì)胞24小時(shí)后的病毒蛋白NP、NS1和M1的亞細(xì)胞定位及病毒蛋白之間的定位關(guān)系。結(jié)果顯示，H3N2、H1N1 SIV和PR8的NP蛋白主要集中分布于感染細(xì)胞的核內(nèi)，但胞質(zhì)中也有分布。SIV的M1蛋白在感染細(xì)胞的胞核、胞質(zhì)均有表達(dá)，但PR8的M1蛋白僅呈點(diǎn)狀分布于細(xì)胞核內(nèi)。SIV的NS1蛋白主要集中分布于感染細(xì)胞的核內(nèi)，PR8的NS1蛋白呈點(diǎn)狀分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。共定位分析顯示，僅在H3N2、H1N1 SIV感染細(xì)胞的核內(nèi)發(fā)現(xiàn)NS1與N

4、P的共定位關(guān)系。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，兩個(gè)不同亞型SIV的NP蛋白與PR8的NP蛋白亞細(xì)胞分布相同，但M1和NS1蛋白的亞細(xì)胞分布存在差異。
　　 2、SIV感染細(xì)胞的胞質(zhì)/胞核亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析
　　 以人肺上皮細(xì)胞A549感染豬流感病毒H3N2為感染模型，采用2-DE結(jié)合MS研究方法分析細(xì)胞感染后24小時(shí)的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)變化動(dòng)態(tài)。MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析結(jié)果表明，胞質(zhì)、胞核組分共有56個(gè)差異蛋白點(diǎn)

5、（對(duì)應(yīng)43種蛋白）被鑒定成功（蛋白分?jǐn)?shù)大于67，p≤0.05）。其中細(xì)胞質(zhì)組分中對(duì)應(yīng)19個(gè)上調(diào)蛋白點(diǎn)和15個(gè)下調(diào)蛋白點(diǎn)，細(xì)胞核組分中包含14個(gè)上調(diào)點(diǎn)和8個(gè)下調(diào)點(diǎn)。差異蛋白的生物功能學(xué)分析表明，SIV感染主要涉及到細(xì)胞死亡、壓力應(yīng)答、脂類代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及RAN轉(zhuǎn)錄和修飾方面。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(IPA)分析表明，H3N2 SIV感染主要激活NF-κB-IFN通路。同時(shí)通過(guò)對(duì)比H1N1 SIV感染，利用免疫印跡(WB)和免疫熒光(IFA)驗(yàn)證

6、了差異蛋白的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞蛋白WARS、IFI35、HSPB1、NMI、GNB1、GNB2等在病毒感染后有表達(dá)上調(diào)及入核的表現(xiàn)。免疫共沉淀分析顯示NS1與hnRNP C2存在相互作用關(guān)系。siRNA干擾和瞬時(shí)過(guò)表達(dá)分析顯示，與SIV H1N1感染細(xì)胞相比，WARS蛋白對(duì)SIV H3N2的M1、NP蛋白的合成量及病毒載量有明顯影響。
　　 3、SIV感染細(xì)胞的線粒體蛋白組學(xué)分析
　　 線粒體作為真核生物細(xì)胞內(nèi)最重要的一

7、種亞細(xì)胞器，參與了細(xì)胞凋亡、能量代謝、應(yīng)激反應(yīng)及免疫應(yīng)答等許多方面。為了分析H3N2亞型豬流感病毒感染A549細(xì)胞后線粒體的應(yīng)答反應(yīng)，本研究采用2-DE結(jié)合MS鑒定方法，分析了SIV H3N2感染A549細(xì)胞后24小時(shí)的線粒體蛋白組變化。2-DE凝膠的比較分析表明，感染前后線粒體蛋白共有29個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生了差異表達(dá)，包括上調(diào)蛋白點(diǎn)16個(gè)，下調(diào)蛋白點(diǎn)13個(gè)。MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜成功鑒定26個(gè)差異蛋白點(diǎn)（蛋白分?jǐn)?shù)大于67，p≤0.0

8、5），對(duì)應(yīng)12種上調(diào)蛋白，11種下調(diào)蛋白。差異蛋白的生物學(xué)功能分析表明，H3N2病毒感染涉及細(xì)胞形態(tài)、免疫應(yīng)答及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)變化。差異表達(dá)蛋白的network網(wǎng)絡(luò)和pathway通路分析結(jié)果表明，氧化磷酸化通路(Oxidative phosphorylation)、整聯(lián)蛋白信號(hào)通路(Integrin signaling)是線粒體應(yīng)答細(xì)胞感染的主要通路。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR對(duì)SIV H3N2感染后24 h的16個(gè)細(xì)胞差異表達(dá)蛋白

9、的轉(zhuǎn)錄本分析表明，RNA加工及蛋白表達(dá)類基因、細(xì)胞死亡相關(guān)基因均是上調(diào)表現(xiàn);細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類基因以上調(diào)為主;細(xì)胞蛋白組裝類基因以下調(diào)為主;能量合成類基因的變化不大。
　　 綜合以上信息，發(fā)現(xiàn)干擾素誘導(dǎo)表達(dá)蛋白Mx1，熱休克蛋白等在三組分中均有明顯上調(diào)，WARS在胞質(zhì)、胞核組分中上調(diào)，hnRNPH家族蛋白在細(xì)胞核中上調(diào)，而在線粒體中下調(diào)。因此，本研究揭示的病毒感染后亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組信息為進(jìn)一步開展SIV跨種間感染的分子致病機(jī)制奠定了