豬巨細(xì)胞病毒感染豬多器官microRNA表達(dá)譜的研究.pdf

1、嚳譬宦墊絲控盟⑧』就￡潮博一_l：學(xué)位論文麴黧嘲誦黼醐辨蓮粼瓣黜㈣辨黼麟醚懶瓣劉驍206=蘋(píng)Ii月中文摘要豬巨細(xì)胞病毒(Porcinecytomegalovirus，PCMV)屬于巨細(xì)胞病毒屬，皰疹病毒科，B皰疹病毒亞科。豬巨細(xì)胞病毒具有二十面體結(jié)構(gòu)并具有雙鏈線狀DNA基因組。PCMV已經(jīng)在世界各地廣泛流行，包括中國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、美國(guó)、日本在內(nèi)的國(guó)家都已證實(shí)了PCMV的流行，并對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅。PCMV是一種免疫抑制病毒，主要抑制T

2、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞系統(tǒng)免疫功能，但其對(duì)免疫系統(tǒng)抑制的機(jī)制并不明確。為了研究PCMV對(duì)宿主免疫器官功能的潛在影響，我們使用轉(zhuǎn)錄組芯片技術(shù)對(duì)PCMV感染的重要豬中樞免疫器官胸腺的轉(zhuǎn)錄物組進(jìn)行了檢測(cè)，并使用健康豬胸腺作為對(duì)照。本研究結(jié)果表明，相對(duì)正常豬胸腺PCMV感染的胸腺中5582種基因發(fā)生顯著差異性表達(dá)，其中2161種基因表達(dá)顯著上調(diào)，而3421種基因表達(dá)顯著下調(diào)。本研究使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)13種顯著差異性表達(dá)的免疫相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)

3、，并使用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步對(duì)這些基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)PCMV感染胸腺中差異性表達(dá)基因的基因功能注釋分析(Geneontologyanalysis)、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析(Geneinteractionnetworkanalysis)、及K_EGG通路分析結(jié)果均表明，PCMV感染廣泛影響包括免疫系統(tǒng)、細(xì)胞代謝過(guò)程、TGF13信號(hào)通路、淋巴受體信號(hào)通路、TNF—a信號(hào)通路在內(nèi)的大量免疫相關(guān)信號(hào)通路。MicroRNA(miR

4、NA)是種在真核生物中廣泛存在的長(zhǎng)度為1824nt的非編碼RNA。而成熟miRNAs對(duì)發(fā)育、造血作用、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、增殖、脂肪代謝、癌癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多生命過(guò)程都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。為了研究miRNA在PCMV感染免疫抑制過(guò)程中發(fā)揮的調(diào)控功能，本研究利用lllumina／Solexa技術(shù)對(duì)感染PCMV的豬肺臟、肝臟、胸腺、腎臟、脾臟及健康豬對(duì)應(yīng)器官進(jìn)行高通量測(cè)序，并對(duì)rniRNA表達(dá)譜進(jìn)行了綜合分析。測(cè)序結(jié)果顯示，胸腺、肺臟、腎臟

5、、脾臟及肝臟miRNA表達(dá)譜中共發(fā)現(xiàn)601種成熟miRNAs表達(dá)，其中有295種為未錄入miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)的新miRNAs。本研究從PCMV感染的多種器官和多種正常器官miRNA高通量測(cè)序表達(dá)譜中挑選12種miRNAs使用Stem100pRTqPCR檢測(cè)手段對(duì)其表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示12種指定miRNA高通量測(cè)序與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果基本一致。基因功能注釋分析(GeneOntologv’GO)結(jié)果表明PCMV感染器官中顯著差異性表達(dá)的m