透邪解毒法抗流感病毒作用機制研究.pdf

1、本課題在深入分析流感病毒致病機理基礎上,采用目前通用的流感動物模型、細胞模型,以肺指數(shù)、病死率為評價指標,證實金柴抗病毒膠囊對不同免疫狀態(tài)流感動物模型的防治作用,以病毒-細胞、病毒-機體-免疫系統(tǒng)的相互作用作為研究對象,運用激光掃描共聚焦、實時熒光定量RT-PCR以及免疫印記Western-Blot等方法,從細胞、分子水平明確金柴抗病毒膠囊抗流感病毒的作用靶點,闡明抗流感病毒作用機制。
　　 本研究分三部分。文獻綜述:主要對流感

2、病毒致病機理以及中醫(yī)藥防治流行性感冒研究進展進行總結(jié)；實驗研究:在明確金柴抗病毒膠囊防治流感作用基礎上,從病毒-細胞、病毒-機體-免疫兩方面對其抗病毒機制進行研究。理論探討:結(jié)合流行性感冒的特點,探討透邪解毒法防治流行性感冒的理論依據(jù)和優(yōu)勢。
　　 1透邪解毒法治療流行性感冒的理論探討
　　 流行性感冒屬于中醫(yī)“時行感冒¨時行傷寒¨時行疫病”等范疇,其病因為“非時之氣”挾“時行疫毒”侵襲人體所致。由于社會發(fā)展、環(huán)境變遷以

3、及人們生活、就醫(yī)習慣的影響,流行性感冒的病邪性質(zhì)和病機變化不再遵循固有的規(guī)律,探索其病機特點、證候演變規(guī)律,并以此確立新的治則治法是中醫(yī)藥行業(yè)的重要任務。
　　 透邪解毒法是針對流行性感冒“在表之邪猶存,趨里之邪易郁化熱”的病機特點而設,以此法為組方依據(jù)的金柴抗病毒膠囊由金銀花、柴胡、蟬蛻等藥組成,全方配伍輕清宣透、引邪外出,清熱解毒祛除病因,參以培補正氣抵御外邪,體現(xiàn)了“早期治療,截斷病勢,防止傳變”的立法宗旨。
　　

4、 2實驗研究
　　 2.1金柴抗病毒膠囊防治流感的作用研究
　　 采用甲型H1N1流感病毒鼠肺適應株(FM/1/47株和PR/8/34株)滴鼻感染正常免疫狀態(tài)和免疫低下小鼠造成肺炎模型,以肺指數(shù)和病死率為評價指標,評價金柴抗病毒膠囊對不同免疫狀態(tài)小鼠甲型流感的防治作用,并與目前世界衛(wèi)生組織推薦治療流感主要藥物達菲進行比較。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊對正常免疫狀態(tài)和免疫低下小鼠肺部炎癥均有明顯的治療和預防作用,并在減輕肺

5、指數(shù)、降低小鼠死亡率、延長小鼠生存時間上,與達菲比較無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.2金柴抗病毒膠囊抗流感病毒作用機制研究
　　 2.2.1對流感病毒吸附環(huán)節(jié)的影響
　　 通過藥物先與細胞作用1小時后,加入流感病毒再作用1小時的方法,采用實時熒光定量RT-PCR,檢測藥物作用細胞后細胞中流感病毒HA-mRNA表達含量。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊能顯著減少細胞中流感病毒HA-mRNA的表達含量,提示金柴

6、抗病毒膠囊可通過干預病毒對細胞吸附環(huán)節(jié)發(fā)揮抗流感病毒作用。
　　 2.2.2對流感病毒-細胞膜融合的影響
　　 通過藥物與流感病毒同時作用細胞的方法,采用激光掃描共聚焦結(jié)合PH值敏感熒光染料,觀察金柴抗病毒膠囊對流感病毒感染細胞后胞內(nèi)PH值變化的影響。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊能顯著降低流感病毒感染細胞后引起胞內(nèi)PH酸化的程度,提示金柴抗病毒膠囊可干預病毒.細胞膜融合環(huán)節(jié)發(fā)揮抗流感病毒的作用。
　　 2.2.3

7、對流感病毒轉(zhuǎn)錄與復制的影響
　　 利用病毒感染細胞1小時后,加入相應稀釋濃度的金柴抗病毒膠囊,作用48-72小時后,采用實時熒光定量RT-PCR法,檢測細胞中流感病毒多聚酶PA亞基mRNA表達含量,觀察金柴抗病毒膠囊對流感病毒多聚酶PA亞基mRNA表達的影響,進一步探討其抗流感病毒作用靶點。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊能顯著降低細胞中流感病毒多聚酶PA亞基mRNA表達含量,提示金柴抗病毒膠囊抗病毒的作用機制與干預流感病毒的轉(zhuǎn)錄和

8、復制有關(guān)。
　　 2.2.4對流感病毒釋放環(huán)節(jié)的影響
　　 利用病毒感染細胞1小時后,加入相應稀釋濃度的金柴抗病毒膠囊,作用72小時,采用熒光Elisa的方法,觀察金柴抗病毒膠囊對流感病毒NA活性的影響。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊對流感病毒NA活性沒有明顯的抑制作用,提示金柴抗病毒膠囊對流感病毒的釋放環(huán)節(jié)沒有影響作用。
　　 2.2.5對病毒載量及γ-IFNmRNA表達的影響
　　 通過甲型H1N1流感

9、病毒鼠肺適應株(FM/1/47株)感染正常小鼠造成肺炎模型的方法,檢測流感病毒感染小鼠后第1天、第3天、第5天以及第7天小鼠肺組織中病毒載量、γ-IFNmRNA的動態(tài)變化情況,探討金柴抗病毒膠囊調(diào)節(jié)機體免疫機制抗病毒作用機理。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊大、中、小3個劑量組對不同時間點肺組織中病毒載量的表達均有明顯的降低作用,對相應時間點小鼠肺組織中γ-IFNmRNA的表達含量均有明顯的升高作用,提示金柴抗病毒膠囊通過上調(diào)γ-IFNmR

10、NA的表達發(fā)揮抗病毒作用。
　　 2.2.6對干擾素誘導跨膜蛋白表達的影響
　　 采用免疫印記Western-Blot的方法,觀察流感病毒感染小鼠后第1天、第3天、第5天以及第7天肺組織中天然抗流感病毒蛋白-干擾素誘導跨膜蛋白(IFITM3)的動態(tài)變化情況,探討金柴抗病毒膠囊抗流感病毒的作用靶點。實驗結(jié)果顯示:金柴抗病毒膠囊在流感病毒感染早期即可調(diào)節(jié)機體產(chǎn)生IFITM3發(fā)揮抗病毒作用,并且在其后幾天內(nèi)與模型組比較,其含量