中藥疫毒清制劑抗流感病毒作用研究.pdf

1、目的： 疫毒清(Depestia)為鴨跖草(CommelinacommunisL)提取物(總生物堿類)。中藥鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草(CommelinacommunisL)的地上部分。采用滲漉技術和離子交換技術提取鴨跖草中具有抗病毒作用的生物堿類成分，制備得到疫毒清制劑。分別作體內(nèi)和體外抗流感病毒研究，體外以MDCK細胞為研究對象，體內(nèi)以昆明小鼠為研究對象，評估疫毒清的藥效。 方法： 1、病毒的增殖與滴定：流感

2、病毒A采用雞胚和MDCK細胞增殖，以血凝實驗判斷病毒效價，MDCK細胞進行病毒TCID50滴定。 2、疫毒清體外抗病毒實驗：將疫毒清由母液對半稀釋得到濃度梯度。MTT法測定藥物的細胞毒性，藥效學實驗在無毒濃度范圍內(nèi)，在96孔細胞培養(yǎng)板加入不同濃度的藥物0.1ml，吸附100TCID50的病毒液0.1ml；采用治療組和預防組兩種給藥方式，每日觀察病毒致細胞病變效應，約在病毒對照組細胞出現(xiàn)+++CPE時用MTT法染色測各孔570nm

3、處OD值并計算半數(shù)抑制濃度(半數(shù)有效濃度)得到藥物的治療指數(shù)。 3、疫毒清體內(nèi)抗病毒實驗：小鼠滴鼻感染流感病毒，建立病毒感染的動物模型。死亡保護作用：將60只小鼠(SPF級，18～20g，雌雄各半)隨機分為6組，每組10只。將給藥組與模型組的小鼠滴鼻感染10ID50病毒液，感染2h后給藥組分別灌胃給予高、中、低濃度的疫毒清與病毒唑，持續(xù)給藥7天，觀察14天，每天觀察并記錄動物的反應、出現(xiàn)死亡的時間和死亡數(shù)。對流感病毒所致肺炎的影

4、響：將給藥組與模型組的小鼠滴鼻感染10ID50病毒液，感染2h后給藥組分別灌胃給予高、中、低濃度的疫毒清與病毒唑，持續(xù)給藥7天，處死動物，無菌取肺，稱肺重，肉眼觀察肺臟變化，計算肺指數(shù)和肺病變抑制率，并做小鼠肺組織病理切片觀察。 4、小鼠肺組織勻漿做RT—PCR流感病毒核酸檢測： 取100mg肺組織經(jīng)過總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄反應，實時熒光定量PCR檢測流感病毒RNA的相對含量，比較給藥組與模型組的差別。 此反應還

5、包括設計引物，確立反應體系，設置反應條件等步驟。 結(jié)果： 1、MTT試驗：藥物組各濃度的光密度OD值(代表活細胞數(shù)目)與病毒對照組的光密度進行組間t檢驗，在高濃度時，P＜0.05，有顯著性差異，說明疫毒清制劑能夠抑制流感病毒增殖，使較多的細胞存活。 2、常規(guī)檢測中，疫毒清各劑量組對小鼠的肺指數(shù)均顯著低于病毒模型組，P＜0．01；存活天數(shù)明顯高于病毒模型組P＜0.05或P＜0．01。 3、RT—PCR檢測：

6、流感病毒RNA的含量(105拷貝/L)為高劑量組：39.29±6.06、中劑量組：36.09±8.19、低劑量組：40.36±8.62均與病毒模型組：50.16±6.73有顯著性差異，P＜0.05。 結(jié)論： 疫毒清體外實驗兩組數(shù)據(jù)的治療指數(shù)(11.06和11.75)，可見疫毒清對流感病毒的治療與預防，均顯示了一定的效果，具有抗流感病毒的作用。疫毒清體內(nèi)實驗肺指數(shù)，存活天數(shù)，肺組織勻漿流感病毒含量，肺組織病理切片等實驗結(jié)果