趨化因子CCL2和長鏈非編碼RNA AVAN抗流感病毒作用機制研究.pdf

1、流感是危害人類健康的重要呼吸道傳染病，曾多次引起全球暴發(fā)流行，奪走數(shù)千萬人生命。流感病毒感染容易造成急性肺損傷（acute lung injury，ALI），嚴重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合癥（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終導致死亡。研究表明，急性肺損傷的產(chǎn)生，一方面是由于病毒本身，另一方面是由于感染引起的過度免疫反應(yīng)導致的“細胞因子風暴”（cytokine storm）。隨著研究的

2、深入，許多和流感病毒感染導致急性肺損傷密切相關(guān)的細胞因子和趨化因子被發(fā)現(xiàn)，但其功能一直存在爭議，并且在禽流感病毒感染中報道甚少，特別是H7N9禽流感病毒介導的急性肺損傷，至今未見報道。
　　隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來越多的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）被發(fā)現(xiàn)和認識，其在生命活動中發(fā)揮著重要作用，如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、個體發(fā)育、神經(jīng)科學等。在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中，雖也有少數(shù)有功能的

3、lncRNA被發(fā)現(xiàn)，但仍存在著大量功能未知的lncRNA，特別是中性粒細胞lncRNA表達譜，至今未見報道。我們設(shè)想找到一條lncRNA，可在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。
　　基于以上研究背景，我們擬從趨化因子和長鏈非編碼RNA功能和機制為切入點，分別從蛋白水平和RNA水平，探討天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒感染導致的急性肺損傷中的作用，開展以下兩部分研究：
　　一、趨化因子CCL2在甲型 H7N9禽流感病毒介導的急

4、性肺損傷中的作用研究
　　為了建立甲型H7N9禽流感病毒介導的急性肺損傷的小鼠模型，我們首先利用H7N9禽流感毒株（Ah01株和Hb01株）感染C57BL/6小鼠，從小鼠體重變化和死亡率結(jié)果來評價感染效果，結(jié)果顯示Hb01株毒力較Ah01株強，能夠使小鼠體重顯著下降，并快速誘導小鼠死亡。我們進一步分析了小鼠肺部病理改變和肺部水腫程度，發(fā)現(xiàn)Hb01株H7N9禽流感病毒能夠有效誘導小鼠產(chǎn)生急性肺損傷，因此我們選擇 Hb01株 H7N9

5、禽流感病毒感染小鼠模型為后續(xù)研究模型。在建模過程中，我們發(fā)現(xiàn)H7N9感染后小鼠的死亡高峰基本在一周出現(xiàn)，與文獻報道的H5N1感染后小鼠死亡情況相似，這提示天然免疫同樣在H7N9感染導致小鼠死亡的過程中發(fā)揮著重要作用。利用獲得性免疫缺陷小鼠（Rag1-/-小鼠）感染H7N9模型，結(jié)果顯示Rag1-/-小鼠感染H7N9后表現(xiàn)出和野生型幾乎相同的死亡率、體重變化以及肺部病理變化，這進一步表明H7N9感染導致小鼠主要在天然免疫階段。
　　

6、為了研究H7N9感染后小鼠的高細胞因子血癥，我們收集了H7N9感染后第5天小鼠的血清和支氣管肺泡灌洗液，進行細胞因子和趨化因子表達譜分析，結(jié)果顯示大部分炎性細胞因子和趨化因子在感染后都有一定程度的升高，其中單核/巨噬細胞最重要的趨化因子CCL2在小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中都明顯升高，且維持在較高水平?？紤]到CCL2的作用及其表達水平，提示CCL2可能在H7N9感染導致的急性肺損傷中起到關(guān)鍵的作用。
　　我們進一步檢測了H7N9感

7、染后小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中CCL2的動態(tài)變化，結(jié)果顯示小鼠感染H7N9后，CCL2從第1天開始便出現(xiàn)明顯的上升，其中在支氣管肺泡灌洗液中，CCL2的表達于第7天達峰，第9天開始回落；而在血清中一直呈高表達水平。通過共聚焦實驗，我們也發(fā)現(xiàn)H7N9感染的小鼠肺組織中有大量的CCL2表達，進一步提示了CCL2具有重要的作用。
　　最后，為了明確CCL2在H7N9感染介導的急性肺損傷中的作用，我們通過CCL2基因敲除小鼠感染H7N9

8、發(fā)現(xiàn)，CCL2基因敲除后，小鼠的死亡率明顯降低，體重下降減緩，且小鼠肺水腫情況明顯改善，肺損傷得到緩解。同時，我們發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后，支氣管肺泡中的中性粒細胞募集顯著增加，相反的，單核/巨噬細胞的募集卻被抑制了。病毒復制實驗顯示CCL2基因敲除后不能影響H7N9在小鼠體內(nèi)的復制。
　　綜上所述，我們首次建立了H7N9感染小鼠致死模型，分析獲得了小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中細胞因子及趨化因子表達譜，明確了CCL2表達的動態(tài)變化，

9、且發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可有效緩解H7N9感染導致的急性肺損傷。我們在進一步實驗中發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可抑制支氣管肺泡中單核/巨噬細胞的募集，增強中性粒細胞募集。這些結(jié)果提示我們中性粒細胞在H7N9感染介導的急性肺損傷過程中可能起到關(guān)鍵作用，啟發(fā)了我們的下一部分工作，同時也為趨化因子在H7N9禽流感病毒感染導致急性肺損傷過程中的研究提供了依據(jù)。
　　二、長鏈非編碼RNA AVAN在天然免疫抗流感病毒中的作用機制研究
　　為

10、了研究lncRNA在天然免疫抗流感病毒中的作用，我們首先利用二代測序檢測了流感病毒感染患者危急重期與其恢復期的外周血中性粒細胞中l(wèi)ncRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)了全新的差異表達的lncRNA共有433條；經(jīng)過篩選進一步確定了一條全新的lncRNA在病毒感染后顯著高表達，我們將其命名為AVAN(anti-virusand activate neutrophils，AVAN)。我們又利用NB和RACE實驗，發(fā)現(xiàn)AVAN只有一個轉(zhuǎn)錄本，長度為517核

11、苷酸，通過核質(zhì)分離和RNA-FISH實驗發(fā)現(xiàn)AVAN均勻分布在細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)。通過檢測 AVAN在病毒感染后的表達，發(fā)現(xiàn)其表達具有一定的劑量依賴和時間依賴。
　　在此基礎(chǔ)上，我們又開展了AVAN功能研究。首先分析了測序結(jié)果中和AVAN表達相關(guān)的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些mRNA主要和流感病毒復制以及天然免疫激活相關(guān)。功能獲得和缺失實驗表明AVAN能夠促進I型干擾素的表達，抑制流感病毒復制；同時，我們也發(fā)現(xiàn) AVAN能夠有效地激活中性粒細

12、胞，增強中性粒細胞的趨化性。
　　為了探究AVAN發(fā)揮抗病毒和增強中性粒細胞活性的具體分子機制，我們首先利用RNA pull down技術(shù)，對差異富集的蛋白進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)AVAN相對于其反義對照序列能夠有效地富集E3泛素連接酶TRIM25；用免疫印跡和RIP實驗進一步驗證AVAN和TRIM25確有直接相互作用。同時，利用IP等實驗，發(fā)現(xiàn)AVAN可增強TRIM25與RIG-I相互作用，促進RIG-I的泛素化，從而激活了RIG-I信

13、號通路，誘導I型干擾素的表達，抑制流感病毒復制。
　　考慮到AVAN同TRIM25相互作用發(fā)生在細胞質(zhì)，而AVAN在細胞核內(nèi)也有大量分布。根據(jù)lncRNA的作用方式，我們推測AVAN可能會通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾，進而影響其他基因的表達發(fā)揮功能?；蚪M定位分析可見，AVAN位于6號染色體，在轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a啟動子區(qū)的反義鏈上。我們構(gòu)建了FOXO3a啟動子區(qū)的雙螢光素酶報告載體，發(fā)現(xiàn)AVAN能夠增強其螢光素酶活性，我們進一步在轉(zhuǎn)錄水平

14、和蛋白水平都驗證了AVAN能夠明顯地促進FOXO3a的表達。為了明確AVAN是否能夠與FOXO3a的啟動子區(qū)直接結(jié)合，我們利用ChIRP實驗，發(fā)現(xiàn)AVAN能夠直接結(jié)合到FOXO3a啟動子區(qū)（-600到-1000nt區(qū)域）。利用ChIP實驗，我們發(fā)現(xiàn)AVAN能夠影響FOXO3a啟動子區(qū)（-600到-1000nt區(qū)域）H3K4me3和H3K27ac兩種組蛋白修飾，以及該區(qū)域RNA聚合酶II的結(jié)合。以上實驗結(jié)果表明AVAN能夠通過反式作用方式

15、來促進FOXO3a的表達。
　　為了進一步全面地了解AVAN對病毒感染后轉(zhuǎn)錄組的變化，我們用流感病毒感染AVAN過表達的細胞，利用mRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)AVAN上調(diào)表達的基因主要富集在I型干擾素通路以及細胞因子分泌通路。這進一步證實了我們前面所發(fā)現(xiàn)的AVAN能夠促進I型干擾素的表達和中性粒細胞活化的結(jié)果。
　　最后，我們利用腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）載體在C57BL/6小鼠體內(nèi)過表達AV

16、AN，然后利用流感病毒感染小鼠，分別從體重變化、死亡率、肺臟的病理改變、水腫程度以及病毒滴度等方面觀察AVAN在小鼠體內(nèi)的作用。我們發(fā)現(xiàn)AVAN過表達后，流感病毒介導的小鼠急性肺損傷的程度明顯得到了緩解，而且肺臟中病毒滴度也有明顯的下降。這證明在流感病毒感染時，AVAN能夠有效地保護小鼠。
　　綜上所述，我們首次獲得了流感病人外周血中性粒細胞lncRNA表達譜；篩選獲得了一條全新的lncRNA AVAN，并對其做了全面的注釋和認識

17、。通過功能實驗發(fā)現(xiàn)AVAN能夠促進I型干擾素的表達而抑制流感病毒復制，同時AVAN還能夠促進中性粒細胞激活，增強其趨化性。在分子機制上，AVAN能夠在細胞質(zhì)中通過與TRIM25相互作用，影響RIG-I信號通路的激活；在細胞核中，AVAN能夠通過反式作用方式促進FOXO3a的表達，增強中性粒細胞的活性。在體內(nèi)實驗中，我們證實AVAN能夠有效緩解流感病毒介導的急性肺損傷。此研究為將來篩選新型抗流感病毒RNA藥物提供了依據(jù)。
　　總之，

18、通過以上兩部分實驗，研究了天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒介導的急性肺損傷中的作用，探索了lncRNA在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)的作用及機制，建立了一整套天然免疫抗病毒研究體系，為今后進一步研究其他呼吸道病毒及新發(fā)突發(fā)傳染病奠定了基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL2是甲型H7N9禽流感病毒感染導致急性肺損傷的重要因素，同時也鑒定出一條全新的lncRNA AVAN在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，為將來篩選新型抗病毒藥物提供了理論依據(jù)