長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19在血管重塑中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:缺血性疾病是當(dāng)今導(dǎo)致人類(lèi)死亡主要病因，盡管血管外科開(kāi)放手術(shù)及腔內(nèi)治療已取得長(zhǎng)足進(jìn)展，很大程度改善了患者預(yù)后，但其遠(yuǎn)期療效仍然令人堪憂(yōu)，因?yàn)閹缀跛谢颊叨茧y以避免因血管重塑導(dǎo)致的再狹窄發(fā)生。由此探究血管重塑機(jī)制具有重要意義。但自傳統(tǒng)血管外科開(kāi)放手術(shù)時(shí)代至今日的腔內(nèi)時(shí)代，血管負(fù)性重塑問(wèn)題一直是臨床治療的難點(diǎn)，其甚至被稱(chēng)作為“血管外科醫(yī)生的挑戰(zhàn)”。血管負(fù)性重塑的主要機(jī)制是，生理狀態(tài)下靜默的血管平滑肌細(xì)胞被活化，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞異常增殖

2、，進(jìn)而新生內(nèi)膜形成。因此，探索血管平滑肌細(xì)胞增殖的病理生理學(xué)機(jī)制是解決血管負(fù)性重塑問(wèn)題的關(guān)鍵。近年來(lái)，研究證實(shí)微小RNA(microRNAs，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)等非編碼RNA對(duì)生理狀態(tài)維持和疾病發(fā)生發(fā)展均有重要作用，逆轉(zhuǎn)了過(guò)去認(rèn)為非編碼RNA無(wú)用的錯(cuò)誤認(rèn)知。研究表明尤其是LncRNA、miRNA具有很強(qiáng)的基因調(diào)控功能，其參與轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白降解過(guò)程。長(zhǎng)鏈非編碼RNAH19

3、(LncRNAH19)發(fā)現(xiàn)于1984年，于1992年證明人類(lèi)亦存在該基因，2007年進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LncRNAH19是miR-675的前體基因。LncRNAH19多在胚胎或腫瘤組織中高表達(dá)，因此被稱(chēng)作“癌基因”。新近研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA的功能具有細(xì)胞/組織特異性，因此本研究旨在探討LncRNAH19在血管平滑肌細(xì)胞中的功能及其在血管重塑中的角色。
　　方法:為了研究LncRNAH19與血管負(fù)性重塑的關(guān)系，我們建立了大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷

4、模型，并檢測(cè)了負(fù)性重塑的模型血管中LncRNAH19和miR-675的表達(dá)。為進(jìn)一步研究LncRNA H19的功能，我們于人胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞系T/GHA-VSMC中過(guò)表達(dá)LncRNAH19，由于LncRNAH19可內(nèi)源性產(chǎn)生miR-675，因此他們提出了LncRNA H19的生物學(xué)功能是由產(chǎn)生miR-675介導(dǎo)的。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，我們運(yùn)用生物信息學(xué)軟件RNAhybrid和DIANA分析miR-675可能作用的靶基因，并用雙螢光素酶報(bào)

5、告基因分析法加以驗(yàn)證。為了進(jìn)一步確定LncRNA H19的生物學(xué)功能是依賴(lài)于miR-675的，我們進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)，即在LncRNA H19過(guò)表達(dá)的T/G HA-VSMC細(xì)胞中沉默miR-675，觀察LncRNA H19對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的生物學(xué)功能是否隨著miR-675的沉默而變化。慢病毒感染和miRNA轉(zhuǎn)染用于調(diào)控LncRNA H19和miR-675表達(dá);T/G HA-VSMC增殖能力
　　通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、Brdu摻入實(shí)驗(yàn)及檢

6、測(cè)PCNA評(píng)價(jià);運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布;蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)量變化，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各類(lèi)RNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較運(yùn)用t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較使用單因素方差分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件運(yùn)用SPSS23.0和GraphPad Prism7完成。
　　結(jié)果:成功建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，術(shù)后1周、3周可見(jiàn)新生內(nèi)膜逐漸增厚;原位雜交法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRN

7、A H19和miR-675表達(dá)量隨著新生內(nèi)膜增厚而增加，Pearson相關(guān)分析證實(shí)LncRNA H19和miR-675表達(dá)量均與新生內(nèi)膜厚度正相關(guān)。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)LncRNAH19后，顯著促進(jìn)了T/G HA-VSMC細(xì)胞增殖，而運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞增殖指標(biāo)PCNA的表達(dá)，亦發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LncRNA H19后顯著上調(diào)了PCNA的表達(dá)，而B(niǎo)rdu摻入實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19過(guò)表達(dá)組其增殖細(xì)胞數(shù)量顯著增加，進(jìn)一步分析細(xì)

8、胞周期，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)LncRNA H19促使細(xì)胞S期、G2/M期細(xì)胞比例增加;綜上證明LncRNA H19具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖功能。此外，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果提示PTEN可能是miR-675的靶基因，依據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建雙螢光素酶質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)miR-675 mimics顯著抑制了野生型質(zhì)粒的螢光素酶活性，而對(duì)突變型質(zhì)粒的螢光素酶活性無(wú)顯著抑制效應(yīng)。進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，RT-qPCR證實(shí)于過(guò)表達(dá)LncRNA H19的T/G H

9、A-VSMC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-675抑制劑miR-675 inhibitor，可顯著降低miR-675的表達(dá)，但不影響LncRNA H19的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上檢測(cè)PTEN、p-AKT、PCNA的表達(dá)量變化，結(jié)果證實(shí)LncRNA H19對(duì)上述蛋白的調(diào)控作用可隨著miR-675的抑制而被削弱。
　　結(jié)論:LncRNA H19及miR-675表達(dá)量與新生內(nèi)膜形成厚度正相關(guān);LncRNAH19具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖功能;LncRNA H