長(zhǎng)鏈非編碼RNa-ATB在HCV相關(guān)纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分：長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB在HCV相關(guān)肝纖維化患者血漿及肝組織的表達(dá)變化
　　目的:
　　明確lncRNA-ATB在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)相關(guān)肝纖維化患者血漿及肝組織的表達(dá)變化，分析血漿lncRNA-ATB作為生物學(xué)標(biāo)記對(duì)HCV相關(guān)肝纖維化的診斷價(jià)值。
　　方法:
　　采用隨機(jī)對(duì)照研究，選擇2014年9月至2015年6月在河北

2、醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院門(mén)診及住院的慢性HCV感染者36例，并選擇15例健康體檢者作為健康對(duì)照。留取外周靜脈血，分別分離血漿、血清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用。HCV感染患者均進(jìn)行肝穿刺活檢術(shù)及肝組織病理檢查，根據(jù)METAVIR評(píng)分系統(tǒng)將HCV患者分為輕度纖維化組(F＜2;n=14)和中至重度纖維化組(2≤F＜4; n=22)。另選5例肝移植供體作為健康對(duì)照組。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)及天門(mén)冬

3、氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平采用酶法檢測(cè);肝組織切片行蘇木素-伊紅（Haematoxylin and eosin，HE）染色及Masson三色染色，觀(guān)察肝組織脂肪變性、炎癥及纖維化程度;免疫組織化學(xué)染色方法評(píng)估肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原α1(alpha-1 typeⅠ collagen，Col1A1)表達(dá);原位雜交方法

4、檢測(cè)肝組織lncRNA-ATB表達(dá);采用Trizol LS提取血漿總RNA，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)血漿lncRNA-ATB表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.患者一般情況:健康對(duì)照組(n=15)，其中男性8例(53.3％)，女性7例(46.7％)，平均年齡（51.2±11.4）歲;HCV感染患者F＜2組(n=14)，其中男性6例(42.9％)，女性8例(57.1％)，平均年齡(48.8±11.6)歲;HCV感染患者2≤F＜4組

5、(n=22)，其中男性12例(54.5％)，女性10例(45.5％)，平均年齡（52.5±7.2）歲。三組年齡之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.596，p=0.555)。
　　2.血清ALT、AST水平:健康對(duì)照組、HCV感染患者F＜2組及HCV感染患者2≤F＜4組血清ALT中位數(shù)分別為17.0、33.0、50.0 U/L，三組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=23.79，p=0.000）;血清AST中位數(shù)分別為15.0、32.0、43.

6、5U/L，三組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=23.33，p=0.000)。
　　結(jié)論:
　　1.肝組織病理學(xué)顯示HCV感染患者肝臟炎癥及纖維化增加，伴隨lncRNA-ATB表達(dá)上調(diào)。
　　2.血漿lncRNA-ATB表達(dá)在HCV感染患者中顯著升高，并在中至重度肝纖維化患者中進(jìn)一步升高。并且血漿lncRNA-ATB水平與HCV相關(guān)肝纖維化分期呈正相關(guān)。
　　3.血漿lncRNA-ATB對(duì)HCV相關(guān)肝纖維化程度具有重

7、要的診斷價(jià)值，有望成為診斷HCV相關(guān)肝纖維化的新型生物學(xué)標(biāo)記。
　　第二部分：
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB在體外活化的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　目的:
　　建立穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的HepG2-CORE細(xì)胞系，探明lncRNA-ATB在HSC活化中的作用。
　　方法:
　　轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HCV核心蛋白質(zhì)粒至HepG2細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的HepG2-CORE細(xì)胞系并進(jìn)行驗(yàn)證;

8、進(jìn)一步應(yīng)用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染HepG2-CORE細(xì)胞以敲除轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGFβ)1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)HCV core表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1水平。將細(xì)胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基處理人肝

9、星狀細(xì)胞系LX-2，同時(shí)應(yīng)用重組人TGFβ1按劑量梯度及時(shí)間梯度處理LX-2細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot及免疫細(xì)胞熒光染色方法檢測(cè)α-SMA、Col1A1表達(dá);細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA-ATB表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的HepG2-CORE細(xì)胞系建立成功:HepG2-CO

10、RE細(xì)胞與對(duì)照HepG2-NC細(xì)胞相比，能夠穩(wěn)定表達(dá)HCV coremRNA和蛋白;培養(yǎng)上清液中TGFβ1水平顯著升高。si-TGFβ1-1能明顯減少HepG2-CORE細(xì)胞TGFβ1 mRNA表達(dá)，并降低細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGFβ1水平。
　　2.HepG2-CORE細(xì)胞培養(yǎng)上清作為條件培養(yǎng)基促進(jìn)HSC活化:HepG2-CORE細(xì)胞培養(yǎng)上清液促進(jìn)LX-2細(xì)胞α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著增加，與之相比，si-TGF

11、β1-1轉(zhuǎn)染后的HepG2-CORE細(xì)胞培養(yǎng)上清液引起LX-2細(xì)胞α-SMA、Col1A1 mRNA及蛋白表達(dá)程度下降。
　　結(jié)論:
　　1.穩(wěn)定表達(dá)HCV核心蛋白的HepG2-CORE細(xì)胞上清液可作為條件培養(yǎng)基促進(jìn)LX-2細(xì)胞活化;
　　2.敲除HepG2-CORE細(xì)胞中TGFβ1表達(dá)，減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TGFβ1水平，并減少LX-2細(xì)胞活化;
　　3.重組人TGFβ1以劑量及時(shí)間依賴(lài)方式促進(jìn)細(xì)胞活化及增殖;

12、
　　4.LncRNA-ATB可能為HSC活化的重要分子標(biāo)志。
　　第三部分：長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA分子調(diào)控機(jī)制預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　目的:
　　預(yù)測(cè)并驗(yàn)證lncRNA-ATB作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA調(diào)控相關(guān)miRNA靶基因的分子機(jī)制。
　　方法:
　　采用分子生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)lncRNA-ATB相關(guān)miRNA及其靶基因，構(gòu)建lncRNA-ATB及靶基因3'-非翻譯區(qū)(untranslat

13、ed regions，UTR)野生型及突變型雙熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒，與miRNA模擬物(mimics)共轉(zhuǎn)染，定量檢測(cè)雙熒光素酶催化產(chǎn)生的熒光數(shù)值，驗(yàn)證miRNA的作用靶點(diǎn)。應(yīng)用miRNA mimics、抑制劑(inhibitor)以及相應(yīng)對(duì)照轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA-ATB、miRNA及α-SMA、Col1A1 mRNA表達(dá)變化;Western blot方法檢測(cè)α-SMA、Col1A1

14、蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.分子生物信息學(xué)預(yù)測(cè)lncRNA-ATB相關(guān)的miRNA及其靶基因:lncRNA-ATB與Ⅱ型TGF-β受體（TGF-β typeⅡ receptor，TGF-βRⅡ）和SMAD2具有相同的miRNA-425-5p結(jié)合位點(diǎn)(CACAGUA)。
　　2.雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA-425-5p與lncRNA-ATB及靶基因結(jié)合:結(jié)果顯示miRNA-425-5p mimics可顯著下

15、調(diào)psi-ATB-wt、psi-TGF-βRⅡ-wt、psi-SMAD2-wt依賴(lài)的熒光素酶活性。
　　結(jié)論:
　　1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)lncRNA-ATB與TGF-βRⅡ和SMAD2具有相同的miR-425-5p結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.靶向調(diào)控miR-425-5p表達(dá)引起LX-2細(xì)胞內(nèi)源性miR-425-5p表達(dá)變化，并能通過(guò)轉(zhuǎn)錄抑制TGF-βRⅡ、SMAD2蛋白表達(dá)及調(diào)節(jié)α-SMA、Col1A

16、1 mRNA及蛋白表達(dá)變化。
　　第四部分：靶向調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB對(duì)肝星狀細(xì)胞活化的作用及分子機(jī)制
　　目的:
　　明確過(guò)表達(dá)及敲除lncRNA-ATB對(duì)HSC活化的影響及潛在的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　構(gòu)建lncRNA-ATB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot方法檢測(cè)α-SMA、Col1A1、TGF-βRⅡ和SMAD2表達(dá);LX-2細(xì)胞增殖通過(guò)C

17、CK-8試劑盒檢測(cè);免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)TGF-βRⅡ和SMAD2表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)lncRNA-ATB、miR-425-5p表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　LncRNA-ATB促進(jìn)LX-2細(xì)胞活化:過(guò)表達(dá)lncRNA-ATB可增加LX-2細(xì)胞α-SMA、Col1A1 mRNA和蛋白表達(dá)，并促進(jìn)LX-2細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:
　　1.過(guò)表達(dá)lncRNA-ATB可通過(guò)降低內(nèi)源性miR-425-5p上調(diào)TG