長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01133在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、結(jié)直腸癌是世界上最常見(jiàn)的威脅人類健康的惡性腫瘤之一。在所有的惡性腫瘤中，結(jié)直腸癌每年的發(fā)病率和死亡率都高居前列。在最近幾年，全世界每年都有超過(guò)60萬(wàn)患者死于結(jié)直腸癌。超過(guò)90％的腫瘤患者死亡是由腫瘤轉(zhuǎn)移引起的。近年來(lái)的研究顯示:惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。EMT是指細(xì)胞在內(nèi)部因素和外界環(huán)境的綜合作用下由上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，

2、獲得了侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。那么惡性腫瘤發(fā)生EMT的分子機(jī)制又是什么呢？之前的大多數(shù)研究都是集中在對(duì)蛋白質(zhì)分子的研究上。然而蛋白質(zhì)分子所對(duì)應(yīng)的mRNA在人類轉(zhuǎn)錄組中只占不到20％，超過(guò)80％的轉(zhuǎn)錄組是不能翻譯成蛋白質(zhì)的。這部分轉(zhuǎn)錄組對(duì)應(yīng)的RNA就是非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。這其中大部分是長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）。lncRNA在轉(zhuǎn)錄組中占據(jù)了絕

3、大部分，它們必將會(huì)發(fā)揮著不可替代的功能，否則數(shù)目眾多的lncRNA對(duì)細(xì)胞就會(huì)是一種負(fù)擔(dān)，與進(jìn)化過(guò)程中生命對(duì)使用物質(zhì)和能量節(jié)約原則相悖。所以lncRNA在調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中也很可能發(fā)揮著重要作用。
　　我們選用TGF-β刺激結(jié)直腸癌細(xì)胞來(lái)構(gòu)建誘導(dǎo)EMT發(fā)生的模型。然后將TGF-β處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，將未處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞作為對(duì)照組。為了鑒定出參與結(jié)直腸癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中的lncRNA，我們對(duì)兩組細(xì)胞做

4、了轉(zhuǎn)錄組微矩陣芯片分析。從中鑒定出了差異表達(dá)的長(zhǎng)lncRNA LINC01133。LINC01133在TGF-β誘導(dǎo)EMT過(guò)程中表達(dá)顯著下調(diào)。于是我們選擇LINC01133作為研究對(duì)象來(lái)研究其在結(jié)直腸癌EMT和轉(zhuǎn)移中的作用，并得出了以下結(jié)論:
　　一、 LINC01133的表達(dá)受到TGF-β的抑制。
　　得到芯片結(jié)果之后，我們重復(fù)了TGF-β刺激構(gòu)建結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT模型試驗(yàn)。并通過(guò)q-RTPCR對(duì)芯片結(jié)果做了驗(yàn)證，證明LI

5、NC01133的表水平確實(shí)能被TGF-β下調(diào)。并且當(dāng)阻斷TGF-β受體或者通過(guò)沉默TGF-β通路下游的smad2后，LINC01133的表達(dá)水平又能恢復(fù)。結(jié)果表明LINC01133是受TGF-β抑制的一條長(zhǎng)鏈非編碼RNA。
　　二、LINC01133抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移。
　　為了研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01133在結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移中的作用。我們使用小干擾RNA在高表達(dá)LINC01133的結(jié)直腸癌細(xì)

6、胞中的敲低LINC01133表達(dá)水平，在低表達(dá)LINC01133的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中過(guò)表達(dá)LINC01133。當(dāng)LINC01133被敲低后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力增強(qiáng)，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin、Twist表達(dá)上調(diào);LINC01133過(guò)表達(dá)后，結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲能力減弱，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin表達(dá)下調(diào)。同時(shí)小鼠尾靜脈注

7、射肺轉(zhuǎn)移模型顯示，LINC01133敲低后結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。同時(shí)結(jié)直腸癌臨床樣本研究表明LINC01133在腫瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，腫瘤組織中LINC01133表達(dá)水平高的患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率低，生存預(yù)后好，并且腫瘤組織中LINC01133表達(dá)水平與E-cadherin呈正相關(guān)，與Vimentin呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明L1NC01133可以抑制結(jié)直腸癌發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　　三、LINC01133與SRSF6相結(jié)合并且可能通過(guò)

8、阻斷SRSF6促EMT的作用來(lái)抑制結(jié)直腸癌EMT和轉(zhuǎn)移
　　(1)鑒定LINC01133的結(jié)合蛋白SRSF6。
　　我們通過(guò)改良ChIRP實(shí)驗(yàn)結(jié)合質(zhì)譜鑒定出LINC01133的結(jié)合蛋白SRSF6。并通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)用SRSF6的抗體進(jìn)行了驗(yàn)證。此外，又通過(guò)RIP反向驗(yàn)證SRSF6蛋白對(duì)LINC01133的結(jié)合作用。經(jīng)過(guò)正反兩方面的驗(yàn)證，我們確認(rèn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01133和SRSF6蛋白有相互作用。<

9、br>　　(2) SRSF6促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移。
　　在鑒定出LINC01133的結(jié)合蛋白SRSF6之后，我們又驗(yàn)證了SRSF6對(duì)結(jié)直腸癌的EMT和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。我們?cè)诟弑磉_(dá)LINC01133的HT29細(xì)胞系、低表達(dá)LINC01133的HCT116細(xì)胞系和不表達(dá)LINC01133的SW620細(xì)胞系中利用慢病毒介導(dǎo)的shRNA將SRSF6干擾敲低。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)SRSF6表達(dá)水平敲低以后，結(jié)直腸細(xì)胞的遷移侵襲能力減弱，上

10、皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin、Twist表達(dá)下調(diào);LINC01133過(guò)表達(dá)后，結(jié)直腸細(xì)胞的遷移侵襲能力減弱，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平表達(dá)上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、Fibronectin等表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果表明SRSF6可以不依賴于LINC01133，單獨(dú)地促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移。
　　(3) LINC01133對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT和轉(zhuǎn)移的抑制用依賴于SRSF

11、6
　　我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC01133對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程的調(diào)控作用是否依賴于SRSF6。當(dāng)SRSF6的表達(dá)被敲低后，LINC01133對(duì)EMT相關(guān)的蛋白標(biāo)志物的調(diào)控以及對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用都減弱了。結(jié)果提示我們長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC01133對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生EMT和轉(zhuǎn)移的抑制作用依賴于其與SRSF6結(jié)合和對(duì)SRSF6促EMT功能的阻斷。
　　綜合以上結(jié)果可以得出結(jié)論:長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC0113