血清中長(zhǎng)鏈非編碼RNA檢測(cè)方法的建立及其在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用.pdf

1、結(jié)直腸癌是我國(guó)乃至全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人們的身心健康。雖然早期結(jié)直腸癌患者治愈率高，5年生存率可達(dá)90％，但由于目前缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)結(jié)直腸癌患者確診時(shí)已為中晚期，其生存率僅為10％～15％。結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而緩慢的過(guò)程，多數(shù)認(rèn)為由腺瘤或者鋸齒狀息肉到早期癌再到進(jìn)展期癌。其演變過(guò)程涉及復(fù)雜的基因和蛋白表達(dá)變化。糖鏈抗原(carbohydrate antigen CA)、癌胚抗原(carcinoembry

2、onic antigen，CEA)等一些表達(dá)變化的分子能有效的篩查中晚期結(jié)腸癌，但對(duì)于早期結(jié)直腸癌的診斷率較低。因此，篩查并驗(yàn)證結(jié)直腸癌相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)譜有利于提高早期結(jié)直腸癌的診斷率，從而提高患者治愈率并延長(zhǎng)生存時(shí)間。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一類長(zhǎng)度為200～100，000 nt且不編碼蛋白的單鏈RNA分子。近年來(lái)，大量研究表明腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后均與lncRNA

3、s的表達(dá)失調(diào)密切相關(guān)，其表達(dá)譜可能作為診斷惡性腫瘤的一類新的生物標(biāo)志物，如HOTAIR、ncRuPAR等。文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)直腸癌組織中多條lncRNAs表達(dá)上調(diào)，且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，如CCAT1、HOTAIR、H19等。最新的研究表明血清中l(wèi)ncRNAs可作為一種有效的非侵襲性的生物標(biāo)志物診斷腫瘤，但在結(jié)直腸癌患者血清中l(wèi)ncRNAs的表達(dá)譜及其檢測(cè)方法極少研究。因此，本研究擬以lncRNAHOTAIR為例，建立血清中l(wèi)ncRNA的

4、檢測(cè)方法，進(jìn)一步采用lncRNA芯片篩選結(jié)直腸癌組織中表達(dá)差異顯著的lncRNAs，并采用qRT-PCR驗(yàn)證候選lncRNAs在結(jié)直腸癌組織及患者血清中的表達(dá)，采用工作特征曲線(ROC)分析lncRNAs的表達(dá)譜在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　目的:建立血清中l(wèi)ncRNA的檢測(cè)方法，評(píng)價(jià)表達(dá)差異的lncRNA在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用。
　　方法:1.采用lncRNA芯片篩選結(jié)腸直癌組織中表達(dá)差異的lncRNAs。
　　

5、采用lncRNA芯片技術(shù)篩查3對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁組織中表達(dá)差異的lncRNAs，按照一定的篩選原則，候選7條lncRNAs，以及文獻(xiàn)報(bào)道在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)的3條lncRNAs，共計(jì)10條lncRNAs作為研究對(duì)象。
　　2.采用qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)差異的lncRNAs。
　　2.1采用TRIzol及TRIzol LS法共提取25對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁組織樣本與67例結(jié)腸癌患者、50例正常志愿者血清樣本中的總RNAs。
　

6、　2.2采用qRT-PCR相對(duì)定量法檢測(cè)已報(bào)道在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的HOTAIR及候選的9條lncRNA的表達(dá)情況:采用PrimeScript結(jié)RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑（大連TaKaRa公司）對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑（大連TaKaRa公司）對(duì)合成的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。組織中以β-actin為內(nèi)參，血清中引入線蟲(chóng)的microRNA(Cel-miR-39)作為

7、內(nèi)參。
　　2.3.ROC分析lncRNAs表達(dá)譜在結(jié)直腸癌診斷中的準(zhǔn)確率。
　　2.4采用Pearson做lncRNAs表達(dá)譜與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CA19-9值的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:1.成功建立血清中l(wèi)ncRNAs(LINC01608、LINC00594、RP11-91J3.3、H19及HOTAIR)的檢測(cè)方法。
　　2.HOTAIR在結(jié)直腸癌組織及患者血清中高表達(dá)，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。1

8、0例配對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁組織樣本中，HOTAIR在8例癌組織中的表達(dá)高于配對(duì)癌旁組織，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在47例結(jié)直腸癌患者及40例正常志愿者血清樣本中，結(jié)直腸癌患者血清中HOTAIR的表達(dá)高于正常志愿者，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNMⅢ/Ⅳ期的結(jié)直腸癌患者血清中HOTAIR的表達(dá)高于正常志愿者，Ⅲ/Ⅳ期高于Ⅰ/Ⅱ期;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及非轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者血清中HOTAIR的表達(dá)均高于正常志愿者，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于非轉(zhuǎn)移患者;ROC分析

9、提示HOTAIR可能作為結(jié)直腸癌診斷的有效標(biāo)志物。
　　3.在結(jié)直腸癌組織中篩選表達(dá)差異顯著的lncRNAs。由lncRNA基因芯片篩選出P＜0.01，lncRNA長(zhǎng)度小于1000bp，高表達(dá)倍數(shù)＞5，且排前7位的lncRNAs，即:LINC01608、XIST、LINC00594、RP11-91J3.3、SEMA3B-AS1、RP11-396O20.2和RP11-867G23.13,加之文獻(xiàn)已報(bào)道在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)的2條ln

10、cRNAs: CCAT1和H19共計(jì)9條lncRNAs。
　　4.LINC00594和RP11-91J3.3在結(jié)直腸癌患者血清中顯著高表達(dá)。在25例配對(duì)結(jié)直腸癌及癌旁組織樣本中，LINC01608、LINC00594、RP11-91J3.3和H19的表達(dá)在兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在67例結(jié)直腸癌患者及50例正常志愿者血清樣本中，LINC00594和RP11-91J3.3在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)高于正常志愿者，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意