H1N1亞型豬流感病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立.pdf

1、豬流感是世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)常見呼吸道病和免疫抑制病，伴隨呼吸困難、咳嗽、流鼻涕、打噴嚏和發(fā)熱等癥狀。豬流感一旦暴發(fā)，將會(huì)給養(yǎng)殖也造成巨大損失，尤其當(dāng)與其它呼吸道病繼發(fā)或混合感染，如豬繁殖與呼吸障礙綜合征等，損失更是無法估量。豬流感除了其重要的獸醫(yī)衛(wèi)生學(xué)意義外，更重要的還在于其顯而易見的公共衛(wèi)生學(xué)意義。 2004年，從廣東省某發(fā)生呼吸道病的豬場(chǎng)采集的病料和棉簽拭子中分離到一株病毒，病毒接種SPF雞胚增殖后進(jìn)行純化。經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)(H

2、1)和神經(jīng)氨酸抑制酶試驗(yàn)(N1)鑒定為H1N1亞型SIV，命名為A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)(簡(jiǎn)稱LM株)。測(cè)定該病毒EID50為10-6.8/mL，TCID50為10-7.2/mL。 采用RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增A/Swine/Guangdong/LM/2004(H1N1)的8個(gè)基因片段，分別將其克隆到pMD18-T載體，進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。核苷酸序列測(cè)定結(jié)果顯示：LM株SIV各基因片段均未

3、發(fā)現(xiàn)核苷酸插入或缺失現(xiàn)象。HA切割位點(diǎn)處的氨基酸序列為IPSIQSR↓G，與高致病性SIV的H1N1亞型毒株的分子特征不符合。HA基因含有8個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，6個(gè)在HA1的第10、11、23、87、276和287位，增加了2個(gè)分別在HA2的154和213位點(diǎn)；NA基因不僅在58，63，68，88和146位含有高度保守的N-糖基化位點(diǎn)，而且在44，235和386位增加了3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，這可能是近期H1N1亞型SIV的一個(gè)分

4、子特征。核苷酸同源性結(jié)果：HA基因與類人譜系的流感病毒分離株有很高的同源性(99％)，而其它基因均與古典豬譜系的流感病毒分離株同源性較高(87％-98％)。從繪制的各個(gè)片段進(jìn)化樹和核苷酸同源性分析結(jié)果，可以推測(cè)該毒株HA基因可能來源于類人譜系的流感病毒；而其它基因來源于古典豬譜系的流感病毒。 序列測(cè)定的基礎(chǔ)之上，將擴(kuò)增的8個(gè)基因片段分別克隆到pHW2000雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體中，構(gòu)建8個(gè)基因的重組陽(yáng)性質(zhì)粒。利用綠色熒光蛋白報(bào)告基因?qū)?/p>

5、聚合酶與核蛋白基因重組質(zhì)?；钚赃M(jìn)行檢測(cè)，并以A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)作為骨架，檢測(cè)各個(gè)片段的活性。將鑒定有活性的各個(gè)片段重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDCK/293T細(xì)胞對(duì)病毒進(jìn)行拯救，首次成功拯救出了全部基因均來自于親本毒株的重組豬流感病毒rH1N1。rH1N1在雞胚中增殖后，測(cè)定血凝效價(jià)為1:64，EID50為10-7.1/mL，TCID50為10-7.6/mL。rH1N1經(jīng)雞胚傳15代后，對(duì)第5、10和15代的HA和N

6、A基因序列測(cè)定結(jié)果顯示，序列均與親本毒株相應(yīng)基因完全一致，說明重組病毒有良好的遺傳穩(wěn)定性，該研究為下一步對(duì)H1N1亞型豬流感病毒致病機(jī)理研究及細(xì)胞培養(yǎng)型疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。將親本株的6個(gè)內(nèi)部基因用禽源高產(chǎn)株A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)的內(nèi)部基因替換，成功拯救出具有高度細(xì)胞適應(yīng)性的重組病毒re-LM，該重組病毒接種MDCK細(xì)胞60h后，血凝價(jià)可以達(dá)到1:1024，具有高產(chǎn)的特性。用該重組病毒制備的油乳劑滅活苗免疫2