流感病毒H1N1亞型血凝素和神經(jīng)氨酸酶的序列分析.pdf

1、流行性感冒(Influenza)簡稱流感,由流感病毒(Influenza virus)引起的急性呼吸道傳染病,流感病毒大致分為A、B、C三種類型。流感每年都有不同規(guī)模的小流行,并且若干年一次全球范圍的大流行,給人類的健康和經(jīng)濟的發(fā)展帶來負面影響。
　　 流感病毒的包膜是包裹在基質(zhì)蛋白之外的一層磷脂雙分子層膜,這層膜來源于宿主的細胞膜,成熟的流感病毒從宿主細胞出芽,將宿主的細胞膜包裹在自己身上之后脫離細胞,去感染下一個目標(biāo)。包膜中

2、有兩種非常重要的糖蛋白:血凝素(hemagglutinin,HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,NA)。
　　 血凝素因為能夠與紅細胞表面的糖蛋白受體結(jié)合,引起紅細胞聚集而得名。HA單體是由3條以非共價形式連接的糖蛋白肽鏈構(gòu)成三聚體。HA的表面有5個抗原決定簇,其抗體能夠抑制血凝以及中和病毒,抑制病毒從感染細胞釋放出來,是重要的保護性抗體。但是HA的氨基酸序列非常容易發(fā)生改變,從而導(dǎo)致HA抗原性的變異,因此,成為流感

3、病毒亞型分類的主要依據(jù)。
　　 每個HA單體可分成兩部分,一部分由HA1構(gòu)成的球形頭部,含有受體位點和抗原決定簇；另一部分為柄,由HA1一部分和整個HA2組成,插入囊膜。HA是流感病毒感染宿主細胞的先決條件,流感病毒通過其表面的HA1區(qū)與宿主細胞膜表面的受體唾液酸結(jié)合,HA2區(qū)與宿主細胞表面發(fā)生膜融合從而使流感病毒進入宿主細胞。故HA1區(qū)對防治病毒侵入宿主細胞有重要意義,因此,本研究以HA1基因為研究重點。
　　 神經(jīng)氨

4、酸酶可以水解宿主細胞表面的糖蛋白N-乙酰神經(jīng)氨酸,釋放成熟的流感病毒體,并防止新生病毒的聚集。NA具有抗原性,抗NA的抗體可以抑制新生流感病毒從宿主細胞中釋放,但不具有中和病毒的作用。因此,HA和NA在流感病毒復(fù)制過程中的作用至關(guān)重要。
　　 本論文的研究內(nèi)容主要由兩個部分組成:
　　 第一部分:2000～2009年H1N1亞型流感病毒血凝素基因HA1的進化分析和序列解析。
　　 這一部分的目的是研究2000-2

5、009年世界各地不同物種的H1N1流感病毒HA1基因的演變特征。首先,從NCBI數(shù)據(jù)庫下載所需序列,采用生物信息軟件對其構(gòu)建種系發(fā)生樹,分析病毒序列的進化關(guān)系。其次,對HA1氨基酸序列進行基因位點特性分析,包括受體結(jié)合位點、抗原決定簇以及潛在糖基化位點的分析,由此來推測該分離株的基因變異情況。
　　 進化樹的結(jié)果顯示:2009年新型流感病毒和2000-2008年人H1N1流感病毒差異較大,不在一個分支上,而與北美H1N1豬流感病

6、毒位于一個小分支,并且有較近的親緣關(guān)系。這說明了,新型流感病毒為變異病毒,并且很有可能由北美洲的H1N1豬流感病毒進化而來。除此之外,豬H1N1毒株部分存在于禽H1N1主干,部分存在于人H1N1主干。說明在進化過程中,豬H1N1與禽、人H1N1都有相似之處,而新型流感病毒又可能由豬流感病毒進化而來,所以導(dǎo)致09年的新型流感病毒跟往年流感病毒相比產(chǎn)生了很大的變異。
　　 HA1蛋白含有5個抗原決定簇,在它的三維構(gòu)象中,A、B抗原決

7、定簇都位于蛋白質(zhì)的頭部,尤其是B簇直接位于抗原結(jié)構(gòu)的最頂部,更容易與抗體接觸而發(fā)生位點變異,而這些變異的毒株更有可能成為新的流感病毒株。新型流感病毒之所以取代2000～2008年的人流感病毒,在2009年占主導(dǎo)地位,因為他們在抗原決定簇發(fā)生突變的位點有20個,涉及4個抗原決定簇。病毒株HA1基因抗原決定簇和多個受體結(jié)合位點發(fā)生變異,并且新型病毒與豬H1N1流感病毒在大多數(shù)變異位點的氨基酸相同。由此可以再次推論,新型流感病毒很大可能是從豬

8、H1N1流感病毒進化而來。
　　 因此,本論文在第一部分的結(jié)論是:2009年新型流感病毒毒株HA1基因可能由早期來自北美洲的H1N1豬流感病毒進化而來,在進化過程中,一些重要位點的變異導(dǎo)致HA1基因發(fā)生抗原性變異,從而導(dǎo)致流感的大爆發(fā)。
　　 第二部分:2000～2009年H1N1亞型流感病毒神經(jīng)氨酸酶的進化分析和序列解析。
　　 這一部分的目的是研究2000-2009年世界各地不同物種的H1N1流感病毒NA基因

9、的演變特征。首先,本論文選取了2000～2009年世界各地的人/豬/禽H1N1亞型流感病毒毒株,從NCBI數(shù)據(jù)庫下載所需序列,采用生物信息軟件對其構(gòu)建種系發(fā)生樹,分析病毒序列的進化關(guān)系。其次,對NA氨基酸序列進行位點基因特性分析,主要包括抗原決定簇、酶活性位點以及潛在糖基化位點的分析,由此來推測該分離株的基因變異情況。
　　 NA氨基酸的進化樹結(jié)果顯示:2009年的新型流感病毒和以往的人流感病毒相隔較遠,而與禽和豬源的流感病毒相

10、隔較近。在2000～2008年人流感病毒組成的分支中,含有一株來源于2000年的禽流感病毒。并發(fā)現(xiàn),他們的NA氨基酸序列具有極高的相似性,可以認為這些毒株之間具有同源性。說明很有可能,人流感病毒和禽流感病毒的NA基因片段發(fā)生了重組,從而導(dǎo)致了NA的抗原轉(zhuǎn)移。
　　 NA蛋白含有7個抗原決定簇,本論文選取的病毒NA序列的抗原決定簇當(dāng)中的大部分位點十分保守,個別發(fā)生變異的抗原位點均位于NA蛋白質(zhì)的頭部。并且發(fā)生變異的這些序列并不十分

11、重要,對NA的抗原性改變沒有特別重要的意義。NA蛋白的酶活性中心位于NA的頭部,本論文當(dāng)中構(gòu)成酶活性中心的氨基酸殘基基本上高度保守,只有少數(shù)個別酶活性發(fā)生變異,并且變異株很少,范圍也不廣。其中一個酶活性位點的變異發(fā)生在兩株來自2008年的人源流感病毒株,由組氨酸H變?yōu)槔野彼醂。還有的酶活性位點的變異發(fā)生在極少數(shù)人/禽/豬流感病毒中,并且變異范圍不是很廣,主要集中在北美和亞洲地區(qū)。有一些流感藥物是專門針對NA酶活性中心設(shè)計的,盡管2000