H1N1和H3N2亞型豬流感病毒的拯救及其致病基因的分析.pdf

1、豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，該病以傳染性強(qiáng)、發(fā)病率高和死亡率低等為特點(diǎn)。豬流感病毒為A型流感病毒，該病毒的基因組為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。這一特點(diǎn)使病毒能通過(guò)基因突變和基因重配不斷進(jìn)化。NS1和PB1-F2蛋白是流感病毒編碼的兩個(gè)重要的非結(jié)構(gòu)蛋白。本研究開(kāi)展了H1和H3亞型豬流感病毒流行情況的血清學(xué)調(diào)查，并分析了NS1和PB1-F2蛋白的突變及基因重配對(duì)古典豬流感病毒生物學(xué)特性的影響。
　　 1.待宰肉豬H1

2、爭(zhēng)H3亞型豬流感病毒抗體血清學(xué)檢測(cè)為了了解待宰肉豬中H1和H3亞型豬流感病毒的流行情況，采用血凝抑制試驗(yàn)對(duì)采集于南京市某3個(gè)肉聯(lián)廠的483份血清樣品進(jìn)行H1和H3亞型豬流感病毒的抗體檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H1亞型抗體陽(yáng)性的血清樣品為32份，陽(yáng)性率為6.6％;H3亞型抗體陽(yáng)性的血清樣品為53份，陽(yáng)性率為10.9％; H1和H3亞型均為陽(yáng)性的血清樣品2份，陽(yáng)性率為0.4％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明被調(diào)查的待宰肉豬受到H1或H3亞型豬流感病毒不同程度的感染

3、。
　　 2.豬流感病毒的拯救及體外生物學(xué)特性的分析為了建立豬流感病毒拯救的反向遺傳操作系統(tǒng)，用RT-PCR方法分別擴(kuò)增出豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2004(GD/04)和A/Swine/Shanghai/1/2005(SH/05)的8個(gè)基因片段，通過(guò)與雙向轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pBD連接，構(gòu)建成含流感病毒8個(gè)基因片段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)重組質(zhì)粒。將含流感病毒8個(gè)基因片段的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，拯救出GD/04和SH/

4、05病毒。拯救出的病毒分別命名為rGD/04和rSH/05。對(duì)rGD/04和rSH/05病毒的生長(zhǎng)曲線、病毒蝕斑形態(tài)、病毒NP蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布和全基因組測(cè)序等進(jìn)行分析后證實(shí)拯救病毒的體外生物學(xué)特性和基因組均與親本病毒保持一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明成功拯救出GD/04和SH/05病毒。GD/04和SH/05病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的成功建立為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.古典豬流感NS1蛋白突變病毒的構(gòu)建及對(duì)小鼠的致病性分析序列分析表明

5、，古典豬H1N1流感病毒的NS1蛋白在過(guò)去80年間不斷進(jìn)化，最顯著的特征為該蛋白C-端最末尾4個(gè)氨基酸殘基序列的變化和該蛋白C-端末尾11個(gè)氨基酸殘基的缺失。然而，發(fā)生在NS1蛋白C-端末尾的這些變化對(duì)古典豬H1N1流感病毒的毒力是否有影響至今仍不清楚。以反向遺傳學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，我們以古典豬H1N1病毒A/Swine/Shanghai/1/2005為框架構(gòu)建出3株NS1蛋白突變病毒（RSEV、GSEI和EPEV）和1株野生型病毒(PEQK

6、)，并以小鼠為動(dòng)物模型分析這些病毒的毒力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RSEV和PEQK病毒都不能在小鼠肺臟中復(fù)制;而GSEI和EPEV病毒卻不需要在小鼠體內(nèi)適應(yīng)就能在小鼠肺臟中復(fù)制。攻毒后第4天，GSEI和EPEV病毒組小鼠肺臟中的病毒滴度分別為2.3×103 pfu/g和0.7×101 pfu/g。對(duì)攻毒后第6天的GSEI和EPEV病毒組小鼠的肺臟進(jìn)行病理分析后發(fā)現(xiàn)這兩株病毒均能在小鼠肺臟中引起輕度的病毒性肺炎（肺泡壁增厚）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，古

7、典豬H1N1流感病毒NS1蛋白C-端最末尾4個(gè)氨基酸殘基序列GSEI和EPEV與該病毒在小鼠上表現(xiàn)出的毒力相關(guān)且能使該病毒跨越種間屏障從豬傳播給小鼠。
　　 4.古典豬流感PB1-F2蛋白突變病毒的構(gòu)建及對(duì)小鼠的致病性分析PB1-F2蛋白是流感病毒PB1基因編碼的一個(gè)小分子量非結(jié)構(gòu)蛋白。研究表明，該蛋白能增強(qiáng)高致病性流感病毒和實(shí)驗(yàn)室小鼠適應(yīng)流感病毒在小鼠模型上的毒力。但PB1-F2蛋白是否也能增強(qiáng)低致病性流感病毒在小鼠模型上的毒

8、力還不清楚。通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù)，我們以低致病性的古典豬H1N1流感病毒(PEQK)為框架，構(gòu)建出一株表達(dá)PB1-F2蛋白的PEQK-F2病毒。我們先前的實(shí)驗(yàn)表明，PEQK病毒不能在小鼠肺臟中復(fù)制，因此我們又以能在小鼠肺臟中復(fù)制的GSEI病毒（PEQK病毒的NS1蛋白突變病毒）為框架，構(gòu)建出一株表達(dá)PB1-F2蛋白的GSEI-F2病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEQK-F2病毒不能在小鼠肺臟中復(fù)制，GSEI-F2病毒在小鼠肺臟中的清除速度比GSEI

9、病毒的快（接毒后第6天仍能在小鼠肺臟中分離到GSEI病毒，而GSEI-F2病毒則在接毒后第4天就分離不到）。上述結(jié)果說(shuō)明，PB1-F2蛋白不能促使PEQK-F2病毒在小鼠肺臟中復(fù)制，但PB1-F2蛋白能加快病毒從肺臟中清除。
　　 5.古典豬流感基因重配病毒的構(gòu)建及對(duì)豚鼠的致病性分析本實(shí)驗(yàn)室于2004年和2005年分別分離到兩株豬流感病毒A/Swine/Gongdong/1/2004(GD/04)和A/Swine/Shangha

10、i/1/2005(SH/05)。實(shí)驗(yàn)表明，GD/04病毒能在豚鼠肺臟中復(fù)制，而SH/05病毒卻不能。為了分析與GD/04病毒感染豚鼠有關(guān)的基因，本實(shí)驗(yàn)以反向遺傳學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，以SH/05病毒為框架，構(gòu)建出5株含GD/04病毒基因的SH-PB2(GD)、SH-NS(GD)、SH-HA，NA(GD)、SH-PB2，HA，NA(GD)和GH-HA，NA，NS(GD)基因重配病毒，并分析這些基因重配病毒對(duì)豚鼠的致病性。攻毒后第3天在豚鼠的氣管和