H3N2亞型流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株遺傳重配研究.pdf

1、流感病毒是嚴(yán)重威脅人類健康的一種急性呼吸道傳染病病原體，每年在全球引起較高的發(fā)病率和死亡率。接種疫苗是預(yù)防和控制流感流行的最有效手段。目前批準(zhǔn)使用的流感疫苗主要有三類:滅活苗、減毒活疫苗和重組HA疫苗。國內(nèi)使用的僅有滅活的裂解疫苗或亞單位疫苗。流感減毒活疫苗以類似自然感染途徑的噴鼻接種，既可刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，又能引起局部黏膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其免疫效果安全有效。流感減毒活疫苗的制備主要是基于流感病毒的基因組為分節(jié)段的RNA，可以利

2、用遺傳重配技術(shù)將減毒供體株和流行株進(jìn)行重配，重配株獲得來自流行株的表面抗原基因和減毒株的表型特征。在該領(lǐng)域研究最多的是俄羅斯和美國，美國采用俄羅斯提供的冷適應(yīng)供體株A/Ann Arbor/6/60(H2N2)和B/Ann Arbor/1/66制備的第一支三價(jià)流感減毒活疫苗Flumist(@)于2003年在美國上市。目前使用的流感減毒活疫苗均以雞胚作為培養(yǎng)基質(zhì)。以雞胚作為基質(zhì)生產(chǎn)的流感減毒活疫苗，存在外源因子污染和將雞傳染病病原體借由活疫

3、苗接種播散到人群中的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)雞胚供應(yīng)周期長(zhǎng)，當(dāng)大流感來襲時(shí)難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)需求，尤其是禽流感病毒來襲時(shí)雞胚來源更受影響。鑒于此，WHO鼓勵(lì)開展以哺乳動(dòng)物細(xì)胞代替雞胚作為流感疫苗生產(chǎn)基質(zhì)的研究。Vero細(xì)胞是WHO批準(zhǔn)生產(chǎn)人用疫苗的傳代細(xì)胞系，但對(duì)流感病毒不敏感，產(chǎn)毒量不穩(wěn)定。目前未見以Vero細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)的季節(jié)性流感病毒減毒活疫苗，選育流感病毒Vero細(xì)胞冷適應(yīng)株對(duì)于流感減毒活疫苗的研發(fā)至關(guān)重要。目前世界各國選育出的Vero細(xì)胞冷

4、適應(yīng)株極為稀少，僅見一株A/Singapore/1/57ca(H2N2)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過梯度降溫培養(yǎng)的方法選育出一株Vero細(xì)胞冷適應(yīng)流感病毒株A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)，已經(jīng)在25℃連續(xù)傳72代，病毒的滴度穩(wěn)定在7.8-8.2lgTCID50/mL。經(jīng)鑒定A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)具有冷適應(yīng)表型(ca)、溫度敏感表型(ts)和減毒表型(att)，并且該毒株在雪貂和小鼠模型上表現(xiàn)出較好的安全

5、性和免疫原性，能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，并能保護(hù)免疫動(dòng)物抵抗同亞型流感病毒的致死性攻擊，提示A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)有可能是制備流感病毒Vero細(xì)胞減毒活疫苗株的理想候選供體株。在本研究中，以實(shí)驗(yàn)室選育的A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)毒株與WHO提供的疫苗生產(chǎn)用流行株A/Solomom Islands/3/2006(H1N1)進(jìn)行傳統(tǒng)遺傳重配方法學(xué)的研究，以建立穩(wěn)定而快速的遺傳重配技

6、術(shù)，并對(duì)重配株病毒reA/SI/2006(H1N1)Vca進(jìn)行生物學(xué)表型特征的鑒定與疫苗安全性和免疫原性的研究，以證明供體株A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)能作為流感病毒Vero細(xì)胞減毒活疫苗的母本毒株。
　　以兩種病毒同時(shí)感染Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和雞胚三種培養(yǎng)基質(zhì)，加羊抗A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)病毒血清中和供體株，并在Vero細(xì)胞25℃條件下培養(yǎng)篩選，最終分別在Vero細(xì)胞33℃和M

7、DCK細(xì)胞25℃成功重配獲得能在Vero細(xì)胞25℃生長(zhǎng)的毒株reA/SI/2006(H1N1)Vca。采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)和單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)重配毒進(jìn)行型別鑒定，結(jié)果證實(shí)重配株病毒抗原性與流行株A/Solomomslands/3/2006(H1N1)一致。進(jìn)一步的基因測(cè)序結(jié)果表明，重配株reA/SI/2006(H1N1)Vca表面抗原基因HA和NA來自流行株A/Solomom Islands/3/2006(H1N1)，6個(gè)內(nèi)部基因來自供體株

8、A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)。在經(jīng)過優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，將重配毒株reA/SI/2006(H1N1)Vca在Vero細(xì)胞25℃連續(xù)傳18代，病毒滴度在7.5lgTCID50/mL以上，傳代過程中病毒型別不發(fā)生改變。
　　重配病毒reA/SI/2006(H1N1)Vca在25℃、33℃和39℃的感染性滴度分別為6.9、7.8和3.5lgTCID50/mL，具有ca、ts表型。以106 TCID50的病毒量滴鼻接種B

9、ALB/c小鼠，免后連續(xù)7天測(cè)定小鼠鼻夾和肺組織的病毒載量，重配株病毒reA/SI/2006(H1N1)Vca組在前五天，上下呼吸道的病毒載量均比疫苗株低了至少3lgTCID50/g，說明重配病毒具有減毒表型。以105 TCID50、106 TCID50和107 TCID50三種劑量對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行二次免疫，能有效刺激小鼠產(chǎn)生針對(duì)流行株病毒A/Solomom Islands/3/2006(H1N1)的血凝抑制抗體和中和抗體，并能促

10、進(jìn)粘膜sIgA的分泌。接種重配病毒reA/SI/2006(H1N1)Vca后，不僅完全保護(hù)小鼠免受同亞型流感病毒A/JN/2009(H1N1)50MLD50病毒量的致死性攻擊，而且能完全抑制攻擊病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。本研究表明，reA/SI/2006(H1N1)Vca是以遺傳重配技術(shù)獲得的既帶有流行株的表面抗原基因，又能在Vero細(xì)胞25℃生長(zhǎng)，并具有減毒表型特征的重配病毒，因此A/Yunnan/1/2005Vca(H3N2)可以用作流