禽源H1N1亞型豬流感病毒HA蛋白特異性單克隆抗體的制備.pdf

1、豬流感(Swine Influenza，SI)是由正粘病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒(Swine Influenza virus，SIV)引起的一種豬的高度接觸的急性傳染性呼吸道疾病。目前為止已發(fā)現(xiàn)的SIV有H1N1、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1及H9N2等多種亞型，禽源H1N1亞型豬流感病毒在我國(guó)豬群中流行的各亞型豬流感病毒中占有重要地位。
　　本研究首先以禽源H1N1亞型豬流

2、感病毒A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(簡(jiǎn)稱SH1)為試驗(yàn)材料，接種MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)72h內(nèi)，待出現(xiàn)細(xì)胞病變后收集細(xì)胞上清。用蔗糖梯度離心的方法，純化病毒。進(jìn)行間接ELISA方法的建立，用于針對(duì)禽源H1N1亞型豬流感病毒抗體的檢測(cè)及篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。研究表明，抗原包被濃度為5.725μg/ml，4℃過(guò)夜；陰、陽(yáng)性血清作1:200稀釋；樣品最佳反應(yīng)作用條件為37℃，1h；酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)作用條件也為37℃，1

3、h。該方法與H3N2亞型豬流感病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒等重要豬病原的陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，本研究建立的禽源H1N1亞型豬流感病毒間接ELISA抗體檢測(cè)方法具有特異性好、操作簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。
　　用4％甲醛對(duì)純化后的病毒進(jìn)行滅活，與弗氏佐劑混合乳化后皮下多點(diǎn)注射，免疫6-8周齡BALB/c雌性小鼠，每只小鼠100μg。之后每隔兩個(gè)周免疫一次，免疫劑量相同。二次免疫后，眼球采血，用ELIS

4、A方法測(cè)其血清抗體效價(jià)。選擇抗體效價(jià)高的小鼠，加強(qiáng)免疫后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，制備雜交瘤細(xì)胞。用HI和ELISA方法對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，再用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)，最后獲得2株H1亞型特異性的雜交瘤細(xì)胞株：1D9、3C7。經(jīng)鑒定兩株單克隆抗體均能與H1N1亞型豬流感病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，且與其他亞型豬流感病毒和其他豬病病原不反應(yīng)，其中3C7為針對(duì)HA蛋白的特異性單抗，為下一步建立H1N