微孢子蟲感染家蠶相關(guān)基因的研究.pdf

1、微孢子蟲是一類廣泛分布于自然界而又極其古老的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能感染從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物幾乎所有的動(dòng)物，是人類以及家蠶(Bombyx mori)、蜜蜂(Apis mellifera)等許多經(jīng)濟(jì)昆蟲的重要病原。感染家蠶的微孢子蟲除微粒子屬(Nosema)之外，還有內(nèi)網(wǎng)蟲屬(Endoreticulatus)微孢子蟲等。感染家蠶的內(nèi)網(wǎng)蟲屬樣微孢子蟲(Endoreticulatus-like Microsporidium)，是蠶種生產(chǎn)中不時(shí)

2、有所發(fā)現(xiàn)的一種小型微孢子蟲，除寄生于家蠶外，還可以感染桑尺蠖(Phthonandria atrilineata)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和斜紋夜蛾(Prodenia litura)等多種鱗翅目昆蟲，對(duì)蠶種生產(chǎn)中微粒子病檢驗(yàn)常造成一定的干擾。感染家蠶的不同種(Species)的微孢子蟲，所寄生的宿主和所處的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境都不一樣，可以推測(cè)不同種的微孢子蟲對(duì)家蠶的感染機(jī)制不同。獲得確定的不同種微孢子蟲，通過比較研究是

3、一種良好的途經(jīng)。本研究直接以純化的內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲嵊州株(Endoreticulatus sp.Shengzhou)的孢子懸浮液(109個(gè)/mL)為模板，克隆了其核糖體RNA基因，通過與其他微孢子蟲的比較研究，確定了其分類定位。該株微孢子蟲核糖體RNA的LSUrRNA、SSUrRNA、ITS和IGS序列長(zhǎng)分別為1757bp、1254bp、499bp和419bp，拼接后獲得核糖體基因全序列長(zhǎng)4431bp，GC含量為43.35％，序列已登錄

4、GenBank，序列號(hào)為JN792450。內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲嵊州株核糖體RNA全基因排列順序?yàn)長(zhǎng)SU-ITS-SSU-IGS-5S，從核糖體RNA基因水平研究了其進(jìn)化定位，進(jìn)一步確定了內(nèi)網(wǎng)蟲屬微孢子蟲嵊州株歸類為內(nèi)網(wǎng)蟲屬，為蠶種生產(chǎn)中微粒子病的檢驗(yàn)提供了一定理論依據(jù)。
　　 盡管不同種的微孢子蟲對(duì)家蠶的感染機(jī)制不同，但感染率的高低會(huì)受孢子發(fā)芽率的影響。諸多研究表明家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白在孢子發(fā)芽以及侵染宿主過程中發(fā)揮重要作用，目前

5、已鑒定出了SWP25和SWP30兩種內(nèi)壁蛋白，以及SWP5、SWP26和SWP32三種外壁蛋白。本研究通過基因克隆、蛋白表達(dá)、SDS-PAGE分析、抗體制備、間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)以及免疫電鏡定位分析，鑒定了家蠶微孢子蟲的一種新的孢壁蛋白SWP12，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為25.56kDa和6.69，定位分析表明該蛋白是一種孢子內(nèi)壁蛋白，該蛋白的多克隆抗體未能明顯抑制微孢子蟲對(duì)宿主細(xì)胞的粘附。該蛋白的一些分子特征有助于我們進(jìn)一步理

6、解微孢子蟲與宿主的互作關(guān)系。
　　 微孢子蟲對(duì)家蠶的感染不僅與其自身的孢壁蛋白相關(guān)，也會(huì)引起宿主細(xì)胞基因的差異表達(dá)變化，微孢子蟲誘導(dǎo)家蠶的基因差異表達(dá)往往和家蠶免疫相關(guān)基因的啟動(dòng)有關(guān)，但有關(guān)家蠶微孢子蟲侵染的BmN細(xì)胞基因差異表達(dá)研究鮮有報(bào)道。本研究采用GeneFishing技術(shù)，通過對(duì)BmN細(xì)胞接種家蠶微孢子蟲，以正常BmN細(xì)胞作對(duì)照，研究了家蠶在微孢子蟲脅迫下相關(guān)基因的差異表達(dá)，從基因組水平上鑒別了10個(gè)受家蠶微孢子蟲誘導(dǎo)或

7、抑制表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄衍生片段(Transcript derivedfragments，TDFs)序列進(jìn)行基因克隆測(cè)序，經(jīng)Blast分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因的功能涉及如下幾個(gè)方面:1)蛋白質(zhì)合成;2)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);3)線粒體呼吸鏈電子傳遞與能量代謝;4)細(xì)胞免疫;5)未知功能蛋白。
　　 家蠶微孢子蟲感染BmN細(xì)胞的差異表達(dá)Akirin基因是新近發(fā)現(xiàn)于果蠅中的天然免疫系統(tǒng)新成員，它在果蠅免疫缺陷(Immune defic

8、iency, Imd)通路中發(fā)揮重要作用。本研究經(jīng)RT-PCR克隆測(cè)序確定其cDNA序列的ORF框含588bp，編碼195個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為21.77kDa和8.97，屬于堿性蛋白質(zhì)，沒有信號(hào)肽位點(diǎn)。Sikmap軟件分析表明Akirin基因位于家蠶第22對(duì)染色體上，微點(diǎn)陣表達(dá)分析表明該基因在家蠶幼蟲的卵巢、精巢、脂肪體和中腸等各種組織均表達(dá)，經(jīng)基因克隆和原核表達(dá)獲得了融合表達(dá)蛋白。這些為進(jìn)一步研究Akirin基因在家