中國非人靈長類隱孢子蟲、賈第蟲及微孢子蟲的分子流行病學(xué)研究和多位點(diǎn)基因分型.pdf

1、隱孢子蟲，賈第蟲和微孢子蟲是在世界范圍內(nèi)引起人和動(dòng)物胃腸疾病的腸道寄生蟲。這些病原體主要通過糞口傳播感染人和動(dòng)物，也可以通過受污染的食物或水感染。非人靈長類動(dòng)物(NHPs)是這些寄生蟲的常見宿主，因此他們被認(rèn)為人體感染潛在的保蟲宿主。然而，關(guān)于這些寄生蟲在非人靈長類的感染率，感染來源，潛在人獸共患風(fēng)險(xiǎn)和遺傳多樣性研究較少。在這項(xiàng)研究中，試圖通過多位點(diǎn)序列分型方法對來自中國不同地區(qū)圈養(yǎng)的和自由放養(yǎng)的非人靈長類動(dòng)物腸道原蟲感染情況進(jìn)行檢測和

2、分析。
　　1.隱孢子蟲
　　通過對隱孢子蟲hsp70（70 kDa heat shock protein）和gp60（60 kDa glycoprotein）基因的PCR擴(kuò)增，對采集的26個(gè)種類2,660份非人靈長類的糞便樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示非人靈長類隱孢子蟲總體感染率為0.7％（19/2,660），包括恒河猴（0.7%），食蟹猴（1.0%），懶猴（10.0%）和葉猴（6.7%）四個(gè)種類。對于不同的飼養(yǎng)方式，猴場(1.1

3、%,12/1,110)和自由飼養(yǎng)(0.6%,7/1,270)的非人靈長類均檢測到陽性。對于不同的地區(qū)，河南地區(qū)感染率為0.6%（5/786），廣西為1.0%(11/1,079)，廣東為1.8%(1/57)和上海為0.7%(2/290)。對于隱孢子蟲感染種類，檢測到的隱孢子蟲屬于Cryptosporidium hominis（14/19）和Cryptosporidium muris（5/19）。C. hominis的gp60亞型分析，存在

4、IbA12G3和IiA17兩種亞型，IbA12G3為優(yōu)勢種。
　　2.十二指腸賈第蟲
　　為調(diào)查和研究賈第蟲的流行性和基因型，使用 SSU rRNA（small-subunit ribosomal RNA）， tpi（triose phosphate isomerase）， gdh（glutamate dehydrogenase），和 bg（beta-giardin）基因多位點(diǎn)分析方法，對采集的43個(gè)種類1,882份非人靈長

5、類的糞便樣品進(jìn)行檢測盒分析。結(jié)果顯示，基于tpi基因，22個(gè)種類的122份（6.5%）非人靈長類的樣本檢測到賈第蟲，包括恒河猴（2.7%），阿薩姆邦獼猴（11.1%），食蟹猴（10.0%）， 長尾獼猴（52.9%），日本獼猴（33.3%），白頭葉猴（0.7%），赤猴（31.3%），白須猴（100%），葉猴（9.1%），金絲猴（13.2%），黑白疣猴（14.3%），白腹長尾猴（16.7%），松鼠猴（22.2%），綠猴（17.7%

6、），懶猴（50.0%），環(huán)尾狐猴（56.5%），山魈（5.1%），阿拉伯狒狒（3.7%），黃狒狒（40.0%），橄欖狒狒（11.8%），白頰長臂猿（14.3%），婆羅洲猩猩（19.2%）。對于不同的地區(qū)，鄭州動(dòng)物園的感染率為9.1%，石家莊動(dòng)物園11.2%，武漢動(dòng)物園7.6%，太原動(dòng)物園13.6%，長沙野生動(dòng)物園44.0%，北京動(dòng)物園22.2%，上海動(dòng)物園8.2%，上海野生動(dòng)物園20.9%，以及河南，廣西和廣東猴場的感染率為2.9%。檢

7、測到的賈第蟲為集聚體A（n=4）和集聚體B（n=118）。對tpi基因序列的分析顯示，集聚體A包括A1，A2和一個(gè)新的亞型。對tpi，gdh和bg基因的多位點(diǎn)分析共檢測到18（7個(gè)已知和11個(gè)未報(bào)到），11（5已知和6個(gè)未報(bào)到）和9（2已知和7個(gè)未報(bào)到）的亞型在115，65和35個(gè)集聚體B分離株中。所有3個(gè)基因位點(diǎn)均成功擴(kuò)增的32個(gè)集聚體B分離株中，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)多位點(diǎn)基因亞型（MLGS），包括2已知和13未報(bào)到MLGs。集聚體B的串聯(lián)序

8、列的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析顯示，這里發(fā)現(xiàn)的MLGs與來自人類，非人靈長類，兔和意大利和瑞典的豚鼠具有遺傳差異。也進(jìn)一步表明，環(huán)尾狐猴和松鼠猴分離的集聚體B與其他非人靈長類的可能存在差異。
　　3.畢氏腸微孢子蟲
　　通過基于畢氏腸微孢子蟲ITS（ribosomal internal transcribed spacer）基因的PCR擴(kuò)增和序列分析，對采集的43個(gè)種類的1,882份非人靈長類的糞便樣品進(jìn)行遺傳特性研究。結(jié)果共檢測到2

9、8個(gè)種類的306份（16.3%）非人靈長類的陽性樣本，感染率從2.6%到100%不等。對于不同地區(qū)，廣東、云南、廣西、四川、河北、河南、湖北、湖南、山西、北京和上海的感染率分別為70.2%、21.5%、8.5%、7.5%、5.6%、29.0%、15.2%、18.2%、37.3%、29.2%和41.4%。圈養(yǎng)猴類（18.9%，288/1,522）的感染率比在自由飼養(yǎng)（5.0%，18/360）的動(dòng)物感染率高。在圈養(yǎng)生活的非人靈長類動(dòng)物，猴場

10、的感染率為13.0%，動(dòng)物園感染率為24.3%和研究所感染率為26.5%。總共發(fā)現(xiàn)34個(gè)畢氏腸微孢子蟲ITS基因型，包括16個(gè)已知基因型(D，O，EbpA，EbpC，EbpD，IV，Henan V，Henan IV，Peru8， Peru11，PigEBITS5，PigEBITS7，CS-1，BEB4，BEB6和I型)和18個(gè)新基因型(CM1-CM18)。感染率最高為基因型D（70/306，22.9%），然后是CM1（58/306，19

11、.0%），Ⅳ型（31/306，10.1%），CM4（28/306，9.2%），EbpC（16/306，5.2%），O（13/306，4.3%），CM16（13/306，4.3%）。其中基因型D，EbpC，CM4和O型在非人靈長類中廣泛分布（9-14種），然而基因型IV型，CM1和CM16分布在1-4種的非人靈長類物種。26個(gè)基因型（263/306，86.0%），不包括基因型BEB4，BEB6，I，CM4，CM5，CM7，CM9和CM18

12、型的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，群1具有人獸共患性。新的基因型CM5，CM7和CM9 BEB4，BEB6和I型聚集在群2。剩余的兩個(gè)基因型（CM4和CM18型），在其他兩個(gè)非人靈長類的基因型之間形成新的集群（群9）。
　　對126份ITS基因陽性的畢氏腸微孢子蟲的群體遺傳分析發(fā)現(xiàn)，屬于IV，D，Peru8， Henan V，Peru11，PigEBITS7，CM1，CM2和CM3基因型。對成功擴(kuò)增所有的4個(gè)微衛(wèi)星和小衛(wèi)星(MS1，MS3，M

13、S4，MS7)及ITS基因的85個(gè)分離株進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，總共發(fā)現(xiàn)59個(gè)多位點(diǎn)基因型。使用多位點(diǎn)和等位基因譜數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖不平衡分析。多位點(diǎn)強(qiáng)和顯著的連鎖不平衡性和限制性重組序列分析顯示，畢氏腸微孢子蟲的克隆群體結(jié)構(gòu)的存在，同樣在等位基因譜數(shù)據(jù)分析中得到驗(yàn)證。F檢驗(yàn)顯示中性突變的缺失和分子選擇的存在，并且比較了常見的ITS基因型(CM1，V，D型)的群體結(jié)構(gòu)。在突變序列強(qiáng)的連鎖不平衡與不顯著的連鎖不平衡和/或 LE的等位基因譜數(shù)據(jù)分析

14、顯示在常見的ITS基因型呈地方群體。種系發(fā)育分析和亞結(jié)構(gòu)分析都沒有顯著的遺傳隔離，也比較了亞群1(主要包括IV型)，亞群2(主要包括CM1型和D型)，亞群3(包括多個(gè)基因型)和亞群4(包括Henan V型)。在突變序列強(qiáng)的連鎖不平衡與不顯著的連鎖不平衡和/或連鎖平衡的等位基因譜數(shù)據(jù)分析顯示在亞群中流行群體的存在。
　　本研究的數(shù)據(jù)得出以下結(jié)論：（1）盡管非人靈長類動(dòng)物隱孢子蟲的總體感染率低，但是具有人畜共患性；（2）賈第蟲集聚體B