家蠶BmeIF3s5基因的克隆、表達(dá)及亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、真核生物翻譯起始因子(eIFs)在蛋白合成中起關(guān)鍵作用,在已經(jīng)鑒定的13個(gè)因子中eIF3(由8個(gè)或更多的亞基組成)是分子量最大的一個(gè)并在翻譯起始過(guò)程中起著核心作用。eIF3s5是eIF3的其中一個(gè)亞基并介導(dǎo)了eIF3大多數(shù)功能的實(shí)現(xiàn)。我們通過(guò)RT-PCR的方法從家蠶蛹中擴(kuò)增到家蠶eIF3s5基因的完整的ORF序列,并將其命名為BmeIF3s5(Bombyx mori eIF3s5),GenBank登錄號(hào)為DQ443287,該基因序列長(zhǎng)為

2、834 bp,編碼278個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)分子量為29.60kD。同源性比較表明該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列在無(wú)脊椎動(dòng)物中具有較高的保守性。將BmeIF3s5基因片段克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,得到重組質(zhì)粒pET-28a(+).BmeIF3s5,經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組正確。將該重組子轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta,工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,裂解菌體作SDS-PAGE分析,與陰性對(duì)照相比在33.

3、28 kD左右的位置有一條特異性蛋白條帶。重組蛋白以包涵體的形式存在,故超聲裂解菌體,分離包涵體并沈滌、溶解,12000rpm離心所得的上清采用親和層析的方法純化融合蛋白。經(jīng)FPLC反相柱層析進(jìn)一步純化后,再進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示該融合蛋白的分子量為34.03 kD,與理論值33.28 kD(融合標(biāo)簽3.81 kD,BmeIF3s529.60 kD)相符。將純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,ELISA檢測(cè)該抗體血清的效價(jià)可達(dá)到1