家蠶Bm-LOC778477蛋白的表達、純化及亞細胞定位研究.pdf

1、首次從構(gòu)建的家蠶蛹cDNA文庫中克隆分析得到一條基因，并將該基因命名為Bm-LOC778477。Bm-LOC778477基因的ORF長為564bp，編碼187個氨基酸殘基，該蛋白理論分子量和等電點分別為21.26kDa和8.94。Bm-LOC778477基因位于家蠶基因組連續(xù)框架Scaffold001541，由3個內(nèi)含子和4個外顯子組成，內(nèi)含子/外顯子切割位點的邊界順序符合Chambon法則。生物信息學分析表明，Bm-LOC778477

2、基因位于W染色體，同時，該基因啟動子區(qū)含有起始子等核心啟動子元件。 構(gòu)建了pGEX-4T-1-Bm-LOC778477重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化于E.coliRosetta((DE3)感受態(tài)細胞，IPTG誘導重組菌表達，SDS-PAGE分析表明GST-Bm-LOC778477融合蛋白以包涵體形式存在。包涵體用8M尿素溶解，復性后的蛋白進行親和層析，凝血酶酶切和再純化。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分子量正確的Bm-LOC778477的蛋白免疫新西蘭大白兔制備多

3、克隆抗體，多克隆抗體經(jīng)ProteinA柱純化，間接ELISA測定純化后的抗體(1mg/ml)效價為1:6,400。 分析家蠶EST數(shù)據(jù)庫，表明Bm-LOC778477基因在家蠶五齡幼蟲第三天的血淋巴、家蠶五齡幼蟲后端絲腺和蛹期有表達。利用免疫印跡技術(shù)在家蠶蛹中能檢測到Bm-LOC778477蛋白，同時間接ELISA法檢測表明，Bm-LOC778477蛋白在Bm5細胞中有明顯的信號。免疫細胞化學表明，Bm-LOC778477蛋白在