家蠶細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BmIce的功能鑒定.pdf

1、細(xì)胞凋亡是指在一定的生理和病理?xiàng)l件下，機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，發(fā)生的受基因控制的、自動(dòng)有序的死亡方式，也稱為程序性細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡廣泛存在于各種組織中，機(jī)體通過凋亡將衰老、畸變和能導(dǎo)致疾病的細(xì)胞清除。細(xì)胞凋亡由基因控制，其核心的分子機(jī)制首先在秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)中得到闡明。作為生物學(xué)、遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)模式昆蟲之一的家蠶，其細(xì)胞凋亡研究尚處于初始階段。目前已在NCBI上登錄克隆序列的家蠶細(xì)胞凋亡相關(guān)

2、基因有：含Bel-2家族同源域BH結(jié)構(gòu)域的BmP109，凋亡抑制因子BmIap，生存因子途徑中的BmCdc2，家蠶白介素轉(zhuǎn)換酶.BmIce和BmIce2，caspaSe活化的DNA.酶抑制劑BmIcad基因和30k蛋白中的6G1基因。其中BmIce在人類、果蠅和線蟲等物種中同源基因的促凋亡功能已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究旨在對(duì)BmIce基因在細(xì)胞凋亡中的功能進(jìn)行鑒定。 本實(shí)驗(yàn)以zdIs5；unc76線蟲為材料，將BmIce的ORF亞

3、克隆至線蟲表達(dá)載體pPD52-102，以研究BmICE對(duì)線蟲細(xì)胞凋亡的影響，從而探索該基因在家蠶細(xì)胞凋亡過程中的作用。此外，利用家蠶全基因組芯片數(shù)據(jù)，分析了BmIce基因表達(dá)譜，并對(duì)BmIce基因在不同因子誘導(dǎo)下家蠶：BmE-SWU1細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行了熒光定量PCR分析，同時(shí)對(duì)不同表達(dá)量的BmIce基因?qū)mE-SWU1細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行了Hoechst核染觀察。 實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： 1 BmIce基因全基因組芯片數(shù)據(jù)

4、分析結(jié)果BmIce在5齡3天不同組織中表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)信息表明：BmIce基因在中腸中表達(dá)量最高，血液次之，表達(dá)量最低為馬氏管；BmIce在不同時(shí)期表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)信息表明：在家蠶幼蟲5齡期間，BmIce基因表達(dá)量較高，上簇后伴隨化蛹的生理發(fā)育過程，表達(dá)量逐漸降低，化蛾前一天表達(dá)量最低。 2 BmIcP基因在線蟲體內(nèi)的凋亡功能檢測以pMD18-T- BmIce質(zhì)粒為模板，使用BmICE primerl上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將B

5、mIce基因的完整ORF連接到pPD52-102載體，構(gòu)建了pPD52-102-BmIce。用pPD52-102-BmIce質(zhì)粒DNA注射zdIs5；unc76線蟲，對(duì)照為pPD52-102空載體，以u(píng)nc76作為標(biāo)記DNA。對(duì)照和目的基因DNA注射濃度均為50ng/μl。注射pPD52-102-BmIce DNA后，在產(chǎn)生的F1代線蟲中，四個(gè)線蟲產(chǎn)生了F2。對(duì)這四個(gè)轉(zhuǎn)基因系的PLM凋亡進(jìn)行觀察。結(jié)果表明四線蟲系總平均凋亡率為30.05

6、﹪；而注射對(duì)照的線蟲產(chǎn)生的F2代其PLM細(xì)胞沒有發(fā)生凋亡。對(duì)PLM細(xì)胞30＃﹪的殺死率表明Bmlce為凋亡促進(jìn)因子。 3 Bmlce基因在家蠶BmE．SWU1細(xì)胞中的凋亡功能檢測為了進(jìn)一步研究BmIce基因?qū)倚Q細(xì)胞凋亡的影響，根據(jù)BmIce基因的eDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，分別以作為對(duì)照的正常家蠶胚胎細(xì)胞BmE-SWU1，BmNPV感染12h的BmE-SWU1細(xì)胞和BmIcP-Bacmid DNA轉(zhuǎn)染12h的BmE-SWU1細(xì)

7、胞eDNA為模板，以家蠶aetin基因?yàn)閮?nèi)部參照，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果表明，BmIce基因在感染BmNPV病毒后的BmE-SWU1細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，而BmIce-Bacmid DNA轉(zhuǎn)染的BmE-SWU1細(xì)胞組又高于病毒感染細(xì)胞組。Hoechst核染結(jié)果顯示：正常的BmE-SWU1細(xì)胞中，發(fā)出強(qiáng)熒光的凋亡小體少，胞質(zhì)分布較均勻；BmNPV感染12h的BmE-SWU1細(xì)胞中，凋亡小體明顯增加，表明隨著BmIce表達(dá)量

8、的增加，細(xì)胞凋亡的程度有所加深；BmIce-BacrnidDNA轉(zhuǎn)染12h的BmE-SWU1大多數(shù)細(xì)胞中均可見明亮清晰的凋亡小體，表明隨著BmIce表達(dá)量的進(jìn)一步增加，細(xì)胞發(fā)生了更為嚴(yán)重的凋亡。 本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)家蠶BmIce基因的細(xì)胞凋亡功能進(jìn)行鑒定，為深入研究家蠶細(xì)胞凋亡機(jī)理奠定基礎(chǔ)。對(duì)家蠶細(xì)胞凋亡相關(guān)基因功能的研究對(duì)揭示家蠶的發(fā)育生物學(xué)、遺傳調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義，并能豐富家蠶作為模式生物的研究內(nèi)容，對(duì)研究家蠶的生長發(fā)