家蠶凋亡相關(guān)基因Ibm1的鑒定及功能分析.pdf

1、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)又稱之為細(xì)胞程序性死亡(Programmedcelldeath，PCD)，是指基因所控制的細(xì)胞主動(dòng)并有序的死亡過程。細(xì)胞凋亡在機(jī)體的發(fā)育、進(jìn)化、器官分化以及維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定等發(fā)揮關(guān)鍵的作用。目前對(duì)于線蟲等低等動(dòng)物中細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究已經(jīng)比較深入，而昆蟲及高等哺乳動(dòng)物中凋亡機(jī)制則較為復(fù)雜，部分機(jī)制尚未明確。線粒體凋亡通路在昆蟲凋亡機(jī)制中的作用更為重要，在果蠅中目前已鑒定了5個(gè)與線粒體相關(guān)的凋亡蛋白，它們的主

2、要作用是拮抗凋亡抑制蛋白(Inhibitapoptosisprotein，IAP)，而引起細(xì)胞凋亡。
　　 在家蠶(Bombyxmori)中，目前只鑒定到一個(gè)IAP拮抗蛋白IBM1。它是果蠅Reaper的同源蛋白。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中家蠶ibm1基因序列特異性的引物，通過反轉(zhuǎn)錄PCR(ReversetranscriptionPCR，RT-PCR)方法擴(kuò)增ibm1基因，并且將PCR擴(kuò)增片段連接到pMD18-simpleT載體上，進(jìn)

3、行測序。結(jié)果表明，該基因片段的閱讀框?yàn)?79bp，編碼93個(gè)氨基酸。
　　 為了檢測家蠶IBM1的凋亡功能，將含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP)的載體與IBM1、IE2、IAP2分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，采用吖啶橙/碘化丙啶(AcridineOrange/PropidiumIodide，AO/PI)雙染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBM1具有顯著的促凋亡作用，并且與表達(dá)抑制凋亡蛋白重組載

4、體共轉(zhuǎn)染之后凋亡作用有明顯的降低。將Ibm1基因片段克隆到pFastBacl-eGFP載體中，構(gòu)建eGFP融合蛋白，生成重組病毒pFastBacl-IBM1-eGFP，進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明IBM1重組病毒定位于線粒體，同時(shí)通過JC-1染色分析，發(fā)現(xiàn)IBM1可以導(dǎo)致線粒體膜電位的降低。
　　 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitativePCR，Q-PCR)技術(shù)檢測Ibm1的表達(dá)變化。家蠶細(xì)胞(BmN)及蠶

5、蛹中的Ibm1在家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus，BmNPV)感染后2小時(shí)表達(dá)量明顯提升并且達(dá)到峰值，表達(dá)量從感染4小時(shí)后開始降低，直至8小時(shí)時(shí)恢復(fù)正常水平。通過對(duì)出芽型病毒粒子(BuddedVirus，BV)產(chǎn)量及CCK-8細(xì)胞增殖檢測法(CellCountingKit-8)的分析發(fā)現(xiàn)，IBM1重組病毒相對(duì)于野生病毒BmNPV感染家蠶細(xì)胞后所產(chǎn)生的病毒滴度大幅降低。CCK-8分析結(jié)果同樣