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文檔簡介
1、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)又稱之為細(xì)胞程序性死亡(Programmedcelldeath,PCD),是指基因所控制的細(xì)胞主動(dòng)并有序的死亡過程。細(xì)胞凋亡在機(jī)體的發(fā)育、進(jìn)化、器官分化以及維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定等發(fā)揮關(guān)鍵的作用。目前對(duì)于線蟲等低等動(dòng)物中細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究已經(jīng)比較深入,而昆蟲及高等哺乳動(dòng)物中凋亡機(jī)制則較為復(fù)雜,部分機(jī)制尚未明確。線粒體凋亡通路在昆蟲凋亡機(jī)制中的作用更為重要,在果蠅中目前已鑒定了5個(gè)與線粒體相關(guān)的凋亡蛋白,它們的主
2、要作用是拮抗凋亡抑制蛋白(Inhibitapoptosisprotein,IAP),而引起細(xì)胞凋亡。
在家蠶(Bombyxmori)中,目前只鑒定到一個(gè)IAP拮抗蛋白IBM1。它是果蠅Reaper的同源蛋白。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中家蠶ibm1基因序列特異性的引物,通過反轉(zhuǎn)錄PCR(ReversetranscriptionPCR,RT-PCR)方法擴(kuò)增ibm1基因,并且將PCR擴(kuò)增片段連接到pMD18-simpleT載體上,進(jìn)
3、行測序。結(jié)果表明,該基因片段的閱讀框?yàn)?79bp,編碼93個(gè)氨基酸。
為了檢測家蠶IBM1的凋亡功能,將含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP)的載體與IBM1、IE2、IAP2分別進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,采用吖啶橙/碘化丙啶(AcridineOrange/PropidiumIodide,AO/PI)雙染色分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBM1具有顯著的促凋亡作用,并且與表達(dá)抑制凋亡蛋白重組載
4、體共轉(zhuǎn)染之后凋亡作用有明顯的降低。將Ibm1基因片段克隆到pFastBacl-eGFP載體中,構(gòu)建eGFP融合蛋白,生成重組病毒pFastBacl-IBM1-eGFP,進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明IBM1重組病毒定位于線粒體,同時(shí)通過JC-1染色分析,發(fā)現(xiàn)IBM1可以導(dǎo)致線粒體膜電位的降低。
應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timequantitativePCR,Q-PCR)技術(shù)檢測Ibm1的表達(dá)變化。家蠶細(xì)胞(BmN)及蠶
5、蛹中的Ibm1在家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染后2小時(shí)表達(dá)量明顯提升并且達(dá)到峰值,表達(dá)量從感染4小時(shí)后開始降低,直至8小時(shí)時(shí)恢復(fù)正常水平。通過對(duì)出芽型病毒粒子(BuddedVirus,BV)產(chǎn)量及CCK-8細(xì)胞增殖檢測法(CellCountingKit-8)的分析發(fā)現(xiàn),IBM1重組病毒相對(duì)于野生病毒BmNPV感染家蠶細(xì)胞后所產(chǎn)生的病毒滴度大幅降低。CCK-8分析結(jié)果同樣
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