油菜抗逆相關(guān)基因的鑒定和功能分析.pdf

1、油菜是重要的油料作物,種子的含油量占其干重的35％-45％。菜油也是非常好的食用油,含有豐富的脂肪酸。菜油也是重要的工業(yè)原料,是我國發(fā)展生物柴油的理想的原料來源之一。因此大力發(fā)展油菜,提高油菜含油量,不僅能為我國能源安全戰(zhàn)略作出重要貢獻,還將有助于保障我國的糧食安全,促進農(nóng)民增收,具有十分重要的戰(zhàn)略意義。然而,油菜經(jīng)常受到高鹽、干旱、低溫和營養(yǎng)缺乏(如低磷、低鉀)等不良非生物脅迫的嚴重破壞,造成油菜產(chǎn)量嚴重下降。通過基因工程手段將一些具

2、有抗逆功能的基因?qū)胫参锘蚪M進而獲得抗逆新品種,這為傳統(tǒng)育種模式的改革帶來了新的契機。
　　 與擬南芥、水稻等傳統(tǒng)模式植物相比,油菜中抗逆基因的鑒定和抗逆機制的研究還比較少。因此,篩選和鑒定油菜中與抗逆相關(guān)的基因,分析揭示其抗逆分子機制,可以為通過基因工程手段來改良油菜抗逆性提供了新的科學依據(jù)。本研究采用Maeroarray技術(shù),從油菜cDNA文庫中篩選了參與高鹽、干旱脅迫應答的基因,并對一些感興趣的目標基因進行了深入的研究。

3、主要結(jié)果如下:
　　 1.通過Macroarray技術(shù)從油菜cDNA文庫中篩選鑒定參與高鹽、干旱脅迫應答的基因
　　 采用Maeroarray技術(shù),從油菜cDNA文庫中共篩選得到313個參與鹽脅迫應答的基因(172個受到高鹽脅迫的誘導,141受到高鹽脅迫的抑制表達):477個參與干旱脅迫應答的基因(288個受到干旱脅迫的誘導,189個受到干旱脅迫的抑制表達);154個基因受到高鹽和干旱兩種脅迫的雙重誘導;104個基因受到

4、高鹽和干旱兩種脅迫的抑制表達。這也說明高鹽脅迫和干旱脅迫之間存在著共同的調(diào)控系統(tǒng)或信號交叉。
　　 2.高鹽干旱脅迫應答基因的表達模式分析
　　 從上述脅迫誘導表達的候選基因中選取了13個基因做進一步的研究。這些基因編碼的蛋白分屬于六個蛋白家族:蛋白激酶家族(MAPKKK和CIPK)、金屬硫蛋白家族、生長素應答或抑制蛋白家族、脂類轉(zhuǎn)運蛋白、直接和脅迫相關(guān)的蛋白、代謝酶類。實時定量RT-PCR分析了這13個基因在鹽脅迫、干

5、旱脅迫的表達模式,同時也分析了6個基因在ABA處理下的表達模式。結(jié)果如下:13個基因中,有7個基因的表達受到鹽脅迫的誘導;12個基因的表達受到甘露醇(模擬干旱脅迫)的誘導,其中包括6個受鹽脅迫誘導的基因;進一步的研究揭示5個受干旱脅迫誘導的基因也受ABA的顯著誘導。這些結(jié)果進一步表明干旱和高鹽脅迫信號、干旱與ABA信號通路之間存在著交叉。組織表達分析結(jié)果顯示,這13個基因可能在油菜的不同組織器官發(fā)育中也發(fā)揮著重要的作用。
　　

6、3.冷調(diào)節(jié)基因BnCOR25的表達分析及功能鑒定
　　 我們從候選的288個干旱誘導的基因中,鑒定了一個新型的編碼冷調(diào)節(jié)蛋白的基因,該基因編碼蛋白的分子量為25KD,因此我們將其命名為BnCOR25(GeneBank號為HM187577)。實時定量RT-PCR結(jié)果顯示BnCOR25基因主要在下胚軸、子葉、莖和花中表達,但是在根和葉子中表達量較低。Northern雜交證實BnCOR25基因的表達受到干旱和冷脅迫的顯著誘導。研究結(jié)果

7、還揭示BnCOR25基因的表達是受ABA信號通路調(diào)節(jié)的。BnCOR25蛋白主要定位于細胞膜上和細胞質(zhì)中。過量表達BnCOR25基因增強了裂殖酵母細胞在冷脅迫下的存活率;過量表達BnCOR25的轉(zhuǎn)基因擬南芥增強了對冷脅迫的耐受性。這些結(jié)果暗示該基因可能在賦予植物對冷脅迫耐受性中起一定的作用。
　　 4.BnCIPK6基因的表達鑒定和啟動子活性分析
　　 在154個受干旱和高鹽脅迫誘導的候選基因中,其中有一個基因編碼的蛋白和

8、擬南芥CIPK蛋白激酶家族的成員CIPK6有很高的同源性,因而被命名為BnCIPK6。BnCIPK6基因的表達受到高鹽脅迫、滲透脅迫、低磷脅迫、ABA和BL的顯著誘導。組織表達分析結(jié)果顯示,BnCIPK6基因主要在花中表達,在子葉中適度表達,而在其它組織中表達水平較低。我們分離得到了約850bp長度的BnCIPK6啟動子片段,組織化學染色分析揭示12天苗齡的擬南芥小苗,下胚軸和子葉中均有很強的GUS信號,而在其它組織中很弱或者檢測不到G

9、US信號;脅迫處理分析揭示BnCIPK6基因的啟動子是受高鹽、滲透脅迫、ABA和BL誘導的。
　　 5.BnCIPK6互作蛋白的篩選及鑒定
　　 酵母雙雜交結(jié)果顯示BnCIPK6可以與擬南芥的CBL1,CBL2,CBL3和CBL9發(fā)生相互作用。將BnClPK6蛋白作為誘餌蛋白篩選油菜cDNA文庫,得到27種與其相互作用蛋白,這些互作蛋白涉及到植物生長發(fā)育、代謝及信號轉(zhuǎn)導等多個方面。其中包括兩個CBL蛋白,分別與AtCBL

10、1和AtCBL3蛋白同源,我們將和AtCBL1同源性較高的油菜CBL蛋白,命名為BnCBL1,BiFC實驗也證明了BnCIPK6和BnCBL1蛋白在體內(nèi)的相互作用。
　　 6.BnCIPK6和BnCBL1蛋白的亞細胞定位及BnCIPK6、BnCIPK6T182D蛋白的體外磷酸化分析
　　 亞細胞定位研究顯示BnCIPK6蛋白在細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核中均有分布,而BnCBL1蛋白定位于細胞膜上。體外激酶磷酸化分析揭示點突變

11、的BnCIPK6T182D蛋白--BnCIPK6(M),相對BnCIPK6蛋白自磷酸化能力更強,表明182位的蘇氨酸殘基是蛋白激活的關(guān)鍵位點。
　　 7.BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1過量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥均顯著增強了對鹽脅迫、低磷脅迫的耐受性
　　 為研究BnCIPK6及BnCBL1基因的功能,我們分別構(gòu)建了BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1過量表達載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥,篩選獲得轉(zhuǎn)基因植

12、株。分別選取這些外源基因在擬南芥中表達量較高的純合株系做表型分析及功能研究。結(jié)果顯示BnCIPK6、BnCIPK6(M)及BnCBL1轉(zhuǎn)基因擬南芥均顯著增強了對鹽脅迫、低磷脅迫的耐受性。結(jié)果說明BnCBL1-BnCIPK6可能通過功能性的相互作用來參與植物對高鹽、低磷脅迫的應答。
　　 8.BnCIPK6和BnCIPK6(M)坳的過量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥增強了對ABA的敏感性
　　 我們分析了轉(zhuǎn)基因植株對ABA的應答,結(jié)果顯

13、示BnCIPK6和BnCIPK6(M)的過量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥均增強了對ABA的敏感性,尤其是后者顯示出了對ABA的超敏性。ABA相關(guān)的Marker基因包括RD29A,ABF3,ABF4在ABA處理后的BnCIPK6(M)的轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達量顯著升高。而我們并未觀察到過量表達BnCBL1的轉(zhuǎn)基因擬南芥對ABA應答的改變。上述結(jié)果表明BnCIPK6參與了對ABA的應答,而BnCBL1沒有參與AJ3A的應答,暗示可能存在和BnCIPK6相

14、互作用的其它CBL蛋白,參與并介導了對ABA的應答。
　　 9.BnCIPK6(M)的過量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對BR應答改變,且提高了對BR合成抑制劑BRZ的敏感性
　　 BnCIPK6(M)過量表達轉(zhuǎn)基因植株改變了對油菜素內(nèi)酯(BR)的應答,提高了對BRZ的敏感性。而我們并未觀察到BnCIPK6和BnCBL1過量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥對BR應答表型的改變。這說明激活形式的BnCIPK6可能參與了BR的信號,同樣暗示可能存在和