豬抗PRRSV相關(guān)基因的鑒定及功能分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合癥（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)引起的一種病毒性傳染病。PRRS導(dǎo)致妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙，仔豬高死亡率以及各年齡段尤其仔豬的呼吸道疾病。PRRSV的基因組是高度可變的，由于這種變異，沒(méi)有有效的疫苗可以利用，即使是接種疫苗，仍有部分豬感染PRRSV，因此培育具有抗PRRSV的豬是解決這一難題的切實(shí)可行的途徑。本研究利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬感染PRRSV后肺臟組織基因表達(dá)譜差異

2、進(jìn)行了研究。在候選基因的研究上，我們對(duì)豬干擾素受體（IFNGR1，IFNAR2）進(jìn)行了克隆,分析了IFNGR1、IFNAR2 mRNA在豬不同組織中的表達(dá)及PRRSV 感染對(duì)其mRNA表達(dá)的影響。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴對(duì)6周齡的大蒲蓮豬及杜-大-長(zhǎng)商品豬進(jìn)行人工攻毒，試驗(yàn)組鼻內(nèi)接種PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株（JXA1），對(duì)照組鼻內(nèi)接種PBS。攻毒后每天直腸測(cè)量體溫，攻毒后0 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d稱量體重、采

3、血并測(cè)定細(xì)胞因子（IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ和INF-a），免疫球蛋白IgG等指標(biāo)并進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)攻毒4 d、7 d、14 d、21 d和28 d血清中的PRRSV進(jìn)行RT-PCR及絕對(duì)real-time PCR的檢測(cè)，結(jié)果表明，攻毒 0-28 d，大蒲蓮豬沒(méi)有出現(xiàn)比較明顯的臨床癥狀；杜-大-長(zhǎng)商品豬則表現(xiàn)出比較明顯的臨床癥狀和病理變化：臨床癥狀有發(fā)燒（體溫高達(dá)42 ℃）、耳部皮膚發(fā)紺、出現(xiàn)紅斑、眼瞼水腫、打噴嚏、

4、呼吸急促，嗜睡等，解剖病理學(xué)變化有肺間質(zhì)增寬、肺水腫，肺臟表面有大小不等，程度不同的出血和淤血；氣管、支氣管出血，淋巴結(jié)水腫、出血；脾臟變硬，有出血點(diǎn)，肺萎縮及胸部積水。攻毒 0 d-14 d，大蒲蓮豬，血清中TNF-α含量顯著升高，血清IL-10的含量變化則不同，14 d 時(shí)大蒲蓮豬仍維持較高的水平，而杜-大-長(zhǎng)商品豬則下降；在大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬中，血清IFN-γ的變化呈現(xiàn)先降后升的動(dòng)態(tài)特征，IgG的含量隨時(shí)間變化呈現(xiàn)上升趨勢(shì)

5、，都在14 d達(dá)到最高峰。血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析結(jié)果表明攻毒后，部分大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬白細(xì)胞總數(shù)偏低或升高，其它指標(biāo)基本沒(méi)有變化。RT-PCR及絕對(duì)real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果表明，大蒲蓮豬血清中PRRSV的含量低于杜-大-長(zhǎng)商品豬。
　　 ⑵利用表達(dá)譜芯片分析了大蒲蓮豬及杜-大-長(zhǎng)商品豬感染PRRSV后肺臟組織差異基因表達(dá)的情況，找到了259個(gè)差異表達(dá)的基因，其中上調(diào)基因105個(gè)，下調(diào)基因154個(gè)，聚類分析表明大蒲蓮豬

6、具有相似的表達(dá)模式，先聚在一類，杜-大-長(zhǎng)商品豬具有相似的表達(dá)模式，聚在另一類。GO分析表明差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，生理學(xué)過(guò)程，發(fā)育過(guò)程，生物調(diào)節(jié)過(guò)程和免疫系統(tǒng)等生物學(xué)過(guò)程。對(duì)其中的12個(gè)基因進(jìn)行了real –time PCR的驗(yàn)證，有11個(gè)基因與基因芯片結(jié)果一致，其中上調(diào)基因6個(gè)，分別是：ENPEP、TF、USP18、Scarb2、CACNA2D1和CYP3A29基因，下調(diào)基因5個(gè)，分別是：GSTA2，CYP3A88、AT

7、P1B1，LPL和MRC1基因。其中，CYP3A29、USP18、IF和ENPEP的mRNA表達(dá)水平，大蒲蓮豬分別是杜-大-長(zhǎng)商品豬的9.09、7.10、6.24和5.43倍，而CYP3A88和GSTA2的mRNA的表達(dá)水平，大蒲蓮豬僅為杜-大-長(zhǎng)商品豬的1 ％和4 ％。通過(guò)對(duì)攻毒前后大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬上述基因表達(dá)水平的對(duì)比分析，初步確定ENPEP、TF、USP18、CYP3A29等為與豬對(duì)PRRSV的抗性有關(guān)的基因，CYP3A

8、88、GSTA2等為與豬對(duì)PRRSV的易感性有關(guān)的基因。
　　 ⑶通過(guò)RT-PCR及 5′-和3′-RACE，我們得到了豬IFNGR1基因完整的cDNA序列，得到兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本只是具有5′-UTR的不同。豬IFNGR1基因核苷酸序列與小鼠，大鼠，人和牛的同源性分別是63.73 ％，62.95 ％,72.90 ％和 81.10 ％。豬IFNGR1基因氨基酸序列與小鼠，大鼠，人和牛的同源性分別是46.69 ％,45.64

9、％，58.04 ％和72.55％。豬IFNGR1基因位于1號(hào)染色體上，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子。對(duì)豬IFNGR1基因的mRNA 14種組織表達(dá)譜進(jìn)行了分析，該基因在檢測(cè)的組織中均表達(dá)，其中，脾臟、淋巴結(jié)，扁桃體、肝臟的表達(dá)相對(duì)強(qiáng)一些，小腸，大腸和子宮中的表達(dá)量弱一些。對(duì)萊蕪豬、杜洛克豬成年豬及仔豬 5種組織中IFNGR1基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了real-time PCR的分析。結(jié)果表明在不同品種、不同組織中IFNGR1基因mRNA

10、的表達(dá)情況存在差異。為了研究PRRSV對(duì)豬IFNGR1基因mRNA表達(dá)的影響，我們選擇了大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬的肺臟，脾臟和淋巴結(jié)進(jìn)行了研究。在大蒲蓮豬感染PRRSV后，肺臟IFNGR1基因mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，然而，淋巴結(jié)IFNGR1基因mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。在杜-大-長(zhǎng)商品豬感染 PRRSV后，肺臟，脾臟，淋巴結(jié)的表達(dá)量有一定的變化，但是沒(méi)有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。
　　 ⑷

11、通過(guò)RT-PCR和5′-RACE技術(shù)，我們獲得了豬IFNAR2 cDNA序列，大小為 2882 bp，豬IFNAR2基因包括9個(gè)外顯子和 8個(gè)內(nèi)含子，其氨基酸序列與小鼠、人、綿羊和牛的同源性分別是38.18 ％、55.29 ％、62.01 ％和63.39 ％。豬IFNAR2基因14種組織中mRNA的表達(dá)的相對(duì)量被檢測(cè)，該基因在檢測(cè)的組織中均表達(dá)，其中，脾臟、小腸、大腦和子宮中的表達(dá)相對(duì)強(qiáng)一些，胃中的表達(dá)量相對(duì)弱一些。我們對(duì)萊蕪豬、杜洛克

12、豬成年豬及仔豬5種組織中IFNAR2基因mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了real-time PCR的分析，結(jié)果表明不同品種、不同組織中IFNAR2基因mRNA表達(dá)水平存在差異。在大蒲蓮豬中，與非感染的對(duì)照組相比，感染PRRSV后，肺臟、脾臟和淋巴結(jié)IFNAR2 mRNA的表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；在杜-大-長(zhǎng)商品豬中，與非感染的對(duì)照組相比，感染PRRSV后，肺臟IFNAR2mRNA的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。
　　 ⑸對(duì)

13、大蒲蓮豬抗PRRSV的機(jī)理進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示，大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬對(duì)PRRSV反應(yīng)不同，在PRRSV感染后肺組織中表達(dá)的基因具有較大差異。首次克隆了豬IFNGR1和IFNAR2基因并對(duì)其組織表達(dá)進(jìn)行了分析，證明PRRSV感染后這兩個(gè)基因分別在大蒲蓮豬和杜-大-長(zhǎng)商品豬淋巴結(jié)和肺以及肺組織中的表達(dá)水平存在差異。本研究找到了一些肺組織中表達(dá)，與豬對(duì)PRRSV的抗性和易感性有關(guān)的基因，為進(jìn)一步探討豬PRRS的發(fā)病機(jī)理以及找到與豬抗PR