豬TLR4基因的突變與功能分析.pdf

1、TLR4（Toll-like receptor4）是九十年代末發(fā)現(xiàn)的，是TLRs受體家族中的一員，屬于一型跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)是富含亮氨酸重復序列（leucine-richrepeat，LRR）的N端。TLR4作為LPS（存在于細胞壁外膜中的內(nèi)毒素成分，在革蘭陰性菌感染的致病機理中起著十分重要的作用）的最重要的模式識別受體.，是將LPS的刺激信號直接傳入細胞內(nèi)的一種跨膜信號受體，在介導革蘭氏陰性細菌及其LPs

2、的宿主反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR4作為LPS信號轉(zhuǎn)導受體，通過MyD88蛋白與IL-1R信號轉(zhuǎn)導途徑重合，最終導致NF-κB的激活，引起各種炎癥因子基因表達。由于TLR4基因為免疫相關(guān)基因，本實驗將其作為豬抗病育種的候選基因進行研究。
　　 本實驗主要研究豬TLR4基因的多態(tài)性及功能，利用PCR-SSCP方法檢測TLR4基因在野豬、民豬、北京黑豬、長白、大白和杜洛克六個豬（品）種中的多態(tài)性，探討不同基因型在不同品系（種）間的分布

3、規(guī)律；構(gòu)建野生型和突變型真核表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染到PK-15細胞，用LPS誘導細胞；用熒光素酶檢測信號傳導通路NF-κB活性；得用Real-time PCR方法檢測LPS誘導前后細胞因子IL-6的表達量。主要研究結(jié)果如下：
　　 1利用PCR-SSCP方法在TLR4基因外顯子3和3’UTR上共尋找到5個單核苷酸突變，其中有3個突變屬于錯義突變。群體遺傳學分析表明，所檢測的5個位點中，6個品種間基因型的分布均存在著極顯著的差異（P<

4、0.01）。
　　 2成功將TLR4基因CDS611bp處進行定點突變，并構(gòu)建了野生型和突變型pcDNA3.1+-TLR4真核表達載體。
　　 3將表達載體、pNF-κB熒光素酶質(zhì)粒和海腎熒光素酶質(zhì)粒以10:10:1的量瞬時轉(zhuǎn)染豬腎上皮細胞（PK-15）24h，后用1μg/ml的LPS誘導細胞12h后NF-κB轉(zhuǎn)錄活性最高（P<0.05）。
　　 4熒光素酶活性檢測結(jié)果為，過表達野生型與突變型TLR4相比，未誘導

5、LPS組兩者之間NF-κB活性存在顯著差異（P<0.05）；而誘導LPS組兩者之間有極顯著差異（P<0.01）。過表達野生型TLR4可促進LPS誘導的NF-κB活性，而過表達突變型TLR4對LPS誘導的NF-κB活性無明顯影響。
　　 5過表達野生型與突變型TLR4相比，未誘導LPS組兩者之間在轉(zhuǎn)錄水平的IL-6表達量存在顯著差異（P<0.05）：而誘導LPS組兩者之間有極顯著差異（P<0.01）。過表達野生型TLR4可促進LP