姜黃4CL和CURS基因的克隆與功能分析.pdf

1、姜黃（Curcuma longaL.）是一種廣泛存在于熱帶、亞熱帶地區(qū)的多年生草本植物。姜黃含有重要的活性物質(zhì)姜黃素，位于姜黃的干燥塊狀莖，它的主要作用體現(xiàn)在抗炎、抗氧化、抗腫瘤、維護(hù)肝和腎的功能等，當(dāng)前對姜黃素的研究方向集中在其重要的藥理活性上。
　　4-香豆酸輔酶A連接酶（4-Coumarate:Coenzyme A Ligase，4CL）位于苯丙烷代謝途徑的分支點(diǎn)上，在姜黃素生物合成途徑中負(fù)責(zé)將肉桂酸催化生成肉桂酰-輔酶 A

2、而使反應(yīng)向生成姜黃素的方向進(jìn)行；姜黃素合成酶（curcumin synthase，CURS）位于姜黃素合成途徑的末端，催化阿魏酸-二酮-輔酶A和阿魏酸-輔酶A反應(yīng)生成姜黃素。本研究采用同源克隆法和RACE技術(shù)，克隆得到姜黃4CL基因序列，并采用同源克隆法擴(kuò)增得到了CURS基因的CDS區(qū)（編碼區(qū)）序列，利用qRT-PCR技術(shù)（熒光定量PCR）分析4CL、CURS基因在姜黃不同組織部位、不同濃度NaCl脅迫下和添加不同濃度SNP后的表達(dá)情況

3、，以期為進(jìn)一步研究4-香豆酸輔酶A連接酶、姜黃素合成酶與姜黃素生物合成之間的關(guān)系提供參考。最后構(gòu)建了 CURS基因的植物表達(dá)載體，為獲得轉(zhuǎn) CURS基因的植株奠定了基礎(chǔ)。主要的研究成果如下：
　　1、通過同源克隆法，得到了426 bp的4CL基因的保守區(qū)序列，運(yùn)用3’RACE技術(shù)得到4CL基因3’端908 bp的序列，5’RACE技術(shù)得到775bp的4CL基因5’端序列，通過DNAstar拼接后得到了2109 bp的4CL基因序列

4、,該基因序列共編碼574個(gè)氨基酸序列。
　　2、生物信息學(xué)分析表明，姜黃4CL基因與生姜（Zingiber officinate）、水稻（Oryzasativa Japonica）、小果野蕉（Musa acuminata）、川桑（Morus notabilis）、啤酒花（Humulus lupulus）、大麻（Cannabis sativa）和土肉桂（Cinnamomum osmophloeum）等植物的同源性達(dá)到了80％以上；姜

5、黃4CL蛋白是位于細(xì)胞質(zhì)中的一種親水性非跨膜的非穩(wěn)定性蛋白，屬于β-折疊型單體蛋白；姜黃4CL蛋白序列的多重序列比對表明其具有和其它植物相同的8個(gè)活性位點(diǎn)，7個(gè)AMP結(jié)合位點(diǎn)和3個(gè)CoA結(jié)合位點(diǎn)；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，姜黃4CL基因與小果野蕉（Musa acuminata），慈竹（Neosinocalamus affinis）聚為一支。
　　3、通過同源克隆法擴(kuò)增得到1173 bp的姜黃CURS基因的CDS區(qū)序列。該序列共編碼390

6、個(gè)氨基酸序列。生物信息學(xué)分析表明，CURS蛋白是一類定位于線粒體膜上的非跨膜親水性穩(wěn)定蛋白，CURS蛋白屬于β-折疊型同源二聚體蛋白，具有Cond_enzymes基因家族典型的結(jié)構(gòu)域，具有3個(gè)活性位點(diǎn)，11個(gè)產(chǎn)物結(jié)合位點(diǎn)，8個(gè)丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)，31個(gè)查爾酮合酶二聚體界面。
　　4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明4CL基因在根中的表達(dá)量最高，葉片和花中的表達(dá)量差別不大，根狀莖中的表達(dá)量最少，在低濃度的NaCl（25 g·L-1）脅迫

7、下，4CL基因的表達(dá)量最高，而在高濃度的條件下4CL基因的表達(dá)量比較低，在SNP作用下，4CL基因的表達(dá)含量呈現(xiàn)出隨著濃度的增大而逐漸減小的趨勢，當(dāng)濃度為0.05 mmol·L-1時(shí)，4CL基因的相對表達(dá)量最高;CURS基因在花中的表達(dá)量最高，葉片和根狀莖中的表達(dá)量差別不大，根中的表達(dá)量最少，不同濃度NaCl脅迫條件下，CURS基因的表達(dá)含量有增有減，在低濃度的NaCl（25 g·L-1）脅迫下CURS基因的表達(dá)量最高，而在SNP作用下